[發(fā)明專(zhuān)利]龜紋瓢蟲(chóng)特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310428805.1
• 申請(qǐng)日: 2013-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103451185A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊帆;王倩;陸宴輝;徐建祥
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及龜紋瓢蟲(chóng)特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

龜紋瓢蟲(chóng)Propylea?japonica（Thunberg）是鞘翅目瓢蟲(chóng)科的捕食性天敵昆蟲(chóng)，常見(jiàn)于農(nóng)田雜草以及果園樹(shù)叢，分布廣泛。龜紋瓢蟲(chóng)能捕食瓢蟲(chóng)、葉蟬、飛虱等多種（類(lèi)）害蟲(chóng)，捕食量大；而且龜紋瓢蟲(chóng)在田間的種群發(fā)生密度高，是我國(guó)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)捕食性瓢蟲(chóng)，在農(nóng)作物害蟲(chóng)種群的自然控制中發(fā)揮著重要作用。

隨著對(duì)瓢蟲(chóng)捕食行為的深入研究，發(fā)現(xiàn)瓢蟲(chóng)間普遍存在集團(tuán)內(nèi)捕食現(xiàn)象，且該現(xiàn)象對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中不同物種的種群動(dòng)態(tài)以及對(duì)害蟲(chóng)生物防治效果產(chǎn)生復(fù)雜而巨大的影響。由于瓢蟲(chóng)種類(lèi)繁多，常規(guī)的腸道解剖、行為觀(guān)察等傳統(tǒng)研究方法無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估瓢蟲(chóng)間集團(tuán)內(nèi)捕食作用。為了準(zhǔn)確鑒定瓢蟲(chóng)種類(lèi)及科學(xué)評(píng)估瓢蟲(chóng)的集團(tuán)內(nèi)捕食作用，需要建立一套快速而準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，但目前還沒(méi)有針對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，可根據(jù)物種特異性引物清楚區(qū)分至種，在物種種類(lèi)鑒定中占據(jù)重要地位。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供龜紋瓢蟲(chóng)特異性COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)龜紋瓢蟲(chóng)的線(xiàn)粒體DNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)特異性COI引物，其包括：

正向引物PjF1：5'-AAATGACCAAATTTATAATGTT-3’

反向引物PjR1：5’-TGATGATAAAGGAGGATAAACT-3’。

本發(fā)明還提供含有引物PjF1和PjR1的用于檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。

本發(fā)明還提供所述引物PjF1和PjR1，以及含有引物PjF1和PjR1的試劑盒在檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種龜紋瓢蟲(chóng)的特異性快速PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1）提取樣品DNA；

2）以步驟1）提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PjF1和PjR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3）分析PCR產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

PCR反應(yīng)條件為：94℃4分鐘；94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共40個(gè)循環(huán)，不用延伸。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)大小為256bp的DNA擴(kuò)增條帶（SEQ?ID?No.3），則判定樣品為龜紋瓢蟲(chóng)。

本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的龜紋瓢蟲(chóng)線(xiàn)粒體DNA序列（Accession?No.KC510124），設(shè)計(jì)一對(duì)特異性COI引物，該引物特異性強(qiáng)，只對(duì)龜紋瓢蟲(chóng)具有擴(kuò)增能力，而對(duì)其近源種、屬瓢蟲(chóng)以及其他昆蟲(chóng)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。采用本發(fā)明提供的方法和引物檢測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)，準(zhǔn)確性高，可擴(kuò)增出256bp大小的片段。PCR檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，一般可在4個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)（視檢測(cè)樣本數(shù)而定），且具有較高的靈敏度，質(zhì)粒濃度檢出限為1.205943134E+04，DNA濃度檢出限為0.00585938ng/μL。本發(fā)明方法在龜紋瓢蟲(chóng)檢測(cè)/監(jiān)測(cè)方面具有很高的實(shí)用價(jià)值，適于基層推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中龜紋瓢蟲(chóng)特異性引物PjF1/PjR1的PCR檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp?ladder；1-114為表1中序號(hào)所對(duì)應(yīng)昆蟲(chóng)的擴(kuò)增結(jié)果，-為陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中龜紋瓢蟲(chóng)特異性引物PjF1/PjR1的DNA濃度梯度檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5000bp?ladder；1-16為模板DNA濃度3ng/μL依次2倍稀釋濃度梯度；-為陰性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中龜紋瓢蟲(chóng)特異性引物PjF1/PjR1的質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp?ladder；1-7為模板質(zhì)粒濃度1.205943134E+07依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式