[發明專利]一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法

無效

• 申請號: 201310427809.8
• 申請日: 2013-09-21
• 公開（公告）號: CN104450831A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 李妮
• 申請（專利權）人: 青島藍農谷農產品研究開發有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）微生物初篩：用無菌水將土樣懸浮制成10%的土壤溶液，兩層濾紙抽濾后得澄清液體，將液體梯度稀釋至10^-5，取稀釋液0.3ml涂布分離培養基平板培養，將單菌落用平板劃線分離方法在分離培養基平板上純化2次，挑取純化后的單菌落點種于初篩培養基平板，32℃溫箱中培養6-7天后，向平板中倒入6ml?3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，將產生透明圈的菌株利用劃線法保存于試管固體斜面培養基上并于4℃保存待用；

（2）微生物復篩：將產生透明圈的菌體接種于復篩培養基中，32℃，135r/min振蕩通氣培養2天，將菌液梯度稀釋至10^-9，取0.3ml?10^-7、10^-8、10^-9的菌液，涂布于初篩培養基中，在32℃溫箱中培養6-7天后，通過測量挑選透明圈相對于菌落較大的菌株，接種于復篩培養基中，32℃、135r/min振蕩通氣培養24h，經平板菌落計數得菌體密度為2×10⁷-3×10⁷個/ml作為種子菌液，肉眼觀察菌落的形態特征；

（3）發酵培養：按2-2.5%?v/v接種量將種子菌液接入5L發酵罐中通過發酵培養基發酵，28-32℃，發酵55-65h；

（4）提取硫酸軟骨素酶：將所得發酵液置于離心機中，4℃、4200r/min離心35min,棄去菌體沉淀，冰浴，在磁力攪拌器的攪拌下，緩緩向發酵上清液中加入硫酸銨至90%的飽和度，4℃層析柜中靜置2天,然后4℃、4200r/min再次離心發酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃層析柜中透析脫鹽，在(NH₄)₂SO₄溶液檢測透析袋外液體不含SO₄^2-的情況下，冷凍干燥；

（5）軟骨預處理：選擇魚軟骨脫脂后將其粉碎，加入3-5％的氫NaOH溶液和氯化鈉溶液在溫度為50-60℃的條件下提取5-6h，過濾后調濾液pH=8-9?；

（6）酶解超濾：向上述濾液加入軟骨投料重量3-5％的步驟（4）制作的硫酸軟骨素酶粉，在pH?值為6-7，溫度為40-50℃的條件下酶解5-6h，在室溫下用截留分子量為8000的超濾膜超濾脫水濃縮至原體積的2/3?；?

（7）制硫酸軟骨素：將超濾脫水后的濃縮液調pH?值為8-9，加入為軟骨投料重量2-3％的雙氧水，在溫度為25-35℃的條件下氧化5-6h過濾，濾液調pH?值為5-6，加入95％乙醇結晶，使乙醇濃度達65-75％，結晶后離心、洗滌、干燥后得到魚硫酸軟骨素。

2.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟（1）中使用的培養基包括硫酸軟骨素?0.5%、(NH₄)₂SO₄?0.5%、K₃PO₄?0.05%、NaCl?0.6%，pH=7.0。

3.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟（2）中使用的培養基包括硫酸軟骨素0.5%、CaSO4·7H₂0?0.6%、KH₂PO₄?0.05%、NaCl?0.6%、冰醋酸1%、酵母浸粉0.8%，pH=7.0。

4.根據權利要求1所述的一種提取魚軟骨中硫酸軟骨素的方法，其特征在于，所述步驟（3）中選用的發酵培養基包括硫酸軟骨素0.7%、CaSO4·7H₂0?0.7%、酵母浸粉0.7%、KH₂PO₄?0.05%、起始pH=6.0。