[發明專利]分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201310426393.8
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN103451309A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 曹以誠;茅莉娜;陳振柳;杜正平;王靜;呂冰凌
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物：內引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的兩對引物為

外引物F3’：

AGTCCATCGGTGACCTGATC

外引物B3’：

AGGACCGCCTCCTGAC

內引物FIP’：

GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA

內引物BIP’：

GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT。

2.根據權利要求1所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液。

3.根據權利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，

所述的BstDNA聚合酶：酶濃度4-10U/μL；

所述的反應液含：1.6～2mmol/LdNTP、20～25mmol/LTris-HCl、10～12.5mmol/LKCl、10～12.5mmol/L（NH₄）₂SO₄、8～10mmol/LMgSO₄、0.1～0.125體積％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿；

所述的樣品預處理液含：10～20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、1～2mmol/LEDTA和1～1.2體積%TritonX-100；

所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen；

所述穩定液為石蠟油；

所述的陽性對照為BCG基因組DNA；

所述的內引物FIP/BIP各為0.2～0.25μmol/L，外引物F3/B3的濃度各為1.2～2.0μmol/L。

4.根據權利要求3所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，

所述的BstDNA聚合酶：酶濃度8U/μL；

所述的反應液含：2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L（NH₄）₂SO₄、10mmol/LMgSO₄、0.125體積％TritonX-100、1mol/L甜菜堿；

所述的樣品預處理液含：20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、2mmol/LEDTA和1.2體積%TritonX-100；

所述的顯色液為SYBRGreenI；

所述的內引物FIP/BIP的濃度各為0.2μmol/L；

所述的外引物F3/B3的濃度各為1.6μmol/L。

5.根據權利要求2、3或4所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括反應管，所述的反應管由管體和管蓋兩部分組成，管體內腔的下部設有將其分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。

6.根據權利要求5所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩定液封存，所述工作液為反應液和BstDNA聚合酶的混合而成。

7.一種使用如權利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；

（2）將步驟（1）的沉淀加入樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA；

（3）在反應容器中加入BstDNA聚合酶0.9～1.8體積份數、反應液38～40體積份數、穩定液52～54.5體積份數、樣品模板DNA4.5～9體積份數、內引物FIP/BIP各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恒溫反應；

（4）在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；

所述步驟（3）中的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的兩對引物。

8.根據權利要求7所述的使用分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，恒溫反應的反應條件為溫度63～65℃，反應時間45～90min。