[發(fā)明專利]EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310426392.3
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103468813A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵琦
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州達健生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種EML4-ALK融合基因熒光定量PCR檢測的試劑盒，適用于肺腺癌中EML4-ALK融合基因突變的檢測。

背景技術(shù)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。近50多年來，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升。1995年全世界有60萬人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升，2003年世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的死亡率是110萬/年，發(fā)病率是120萬/年。肺癌的病因至今尚不完全明確，醫(yī)學(xué)統(tǒng)計表明肺癌的致病因素主要為吸煙（包括二手煙），80%的男性肺癌和75%的女性肺癌是由吸煙造成的，此外與石綿、氡、砷、電離輻射、鹵素烯類、多環(huán)性芳香化合物、鎳等工業(yè)致癌物的接觸，種族、家屬史對肺癌的發(fā)病均有影響。

肺癌分小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC），NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞癌、類癌等。NSCLC占所有肺癌病例的80%—90%，嚴(yán)重威脅人類健康。NSCLC的治療包括手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療及生物免疫治療等多種方法。手術(shù)治療是NSCLC最佳治療方法，但當(dāng)NSCLC發(fā)現(xiàn)時，僅20%—30%的病例有手術(shù)指征，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達50%以上。分子靶向治療以其符合生理、低毒和理論上高效的特點，越來越成為非小細胞肺癌治療的熱點。靶向治療為肺癌的治療增添了一個新的領(lǐng)域，也為肺癌的治療帶來了新的希望。

分子靶向治療是一種針對腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的細胞信號傳導(dǎo)及其他生物學(xué)途徑的治療手段，其特點是能選擇性地作用于腫瘤細胞，定向阻斷癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、信號傳導(dǎo)，阻止腫瘤新生血管的生成，破壞癌細胞的新陳代謝，故特異性高，不良反應(yīng)小，擁有良好的發(fā)展前景。肺癌靶向治療涉及腫瘤細胞生長的多個重要環(huán)節(jié)，目前研究較為成熟且應(yīng)用于臨床的主要有兩個作用點，一個是血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR），另一個為表皮生長因子受體（EGFR）。此外，還有最新發(fā)現(xiàn)的棘皮動物微管結(jié)合蛋白4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm?microtubule?associated?protein?like4，EML4-ALK）融合基因。已有研究提示該融合基因可能存在于肺癌在內(nèi)的多種實體腫瘤，但以NSCLC的檢出率最高，同時因其與EGFR突變、K-ras突變的不共存現(xiàn)象以及含有EML4-ALK基因患者的鮮明臨床特征，提示該靶點是肺腺癌特異性較高的分子標(biāo)記物。EML4-ALK的發(fā)現(xiàn)定義了NSCLC的一個新亞型，堪稱近年來NSCLC研究史上一個里程碑式的事件。編碼EML4的基因位于2號染色體短臂的21號基因座位，而編碼ALK的基因位于2號染色體23號基因座位，兩者在染色體上相隔約1270萬個堿基對，且轉(zhuǎn)錄方向相反。基因融合時，EML4基因在染色體上發(fā)生斷裂，形成不同長度的外顯子拼接片段，調(diào)轉(zhuǎn)方向，插人位置相對保守的ALK基因19、20外顯子之間，從而形成長度不等的各種EML4-ALK融合變體，目前，至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種變異亞型，分別為亞型1（E13；A20）（這種命名法指的是EML4的13號外顯子與ALK的20號外顯子發(fā)生融合）、亞型2（E20；A20）、亞型3（E6a/b；A20）、亞型4（E14；A20）、亞型5（E2a/b；A20）、亞型6（E13；A20）（注：亞型6為EML4的第13外顯子加上一個49bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連）、亞型7（E14；A20）、亞型8（E15；A20）、亞型9（E18；A20）。最常見的融合變體為亞型1（E13；A20），其次為亞型3（E6a/b；A20），經(jīng)檢測，這兩種變體在EML4-ALK融合基因NSCLC患者的發(fā)生率分別為33%和29%。所有這些融合基因均有生物學(xué)功能，表達產(chǎn)物為一種嵌合型酪氨酸激酶。EML4-ALK融合變異日前已經(jīng)被鑒定為NSCLC，特別是肺腺癌的一個獨特的分子亞型，EML4-ALK融合基因陽性患者有其獨特的臨床病理特征。針對這一靶點的檢測，將有助于篩選EGFR-TKI合適的治療人群并開啟NSCLC靶向治療的新領(lǐng)域。

目前國際上檢測EML4-ALK融合基因常見的技術(shù)方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、熒光原位雜交（FISH）、免疫組織化學(xué)（IHC）、RACE-偶聯(lián)PCR測序（RACE-coupled?PCR?sequencing）。