[發(fā)明專利]急性腎損傷診斷NGAL膠體金免疫測試盒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310426318.1
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN104459133A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設計）人: 劉宏飛
• 申請（專利權）人: 劉宏飛
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及NGAL蛋白的抗體對的制備，膠體金標記顯色的免疫層析反應技術和利用NGAL的抗體來早期診斷急性腎損傷的技術領域。尤其涉及一種急性腎損傷早期診斷檢測試劑板。

技術背景

本發(fā)明的主要技術背景包括NGAL的特異性、膠體金的快速簡便、雙抗體技術的敏感準確。

急性腎損傷(acute?kidney?injury，AKI)是由各種原因引起的腎功能在短時間(幾小時至幾天)內突然下降而出現(xiàn)的臨床綜合征，是威脅重癥患者生命的常見疾病。重癥監(jiān)護病房中約50％的患者可合并此癥，AKI的終末階段急性腎功能衰竭(acuterenal?failure，ARF)，其病死率高達26.5％-45％。目前探尋一種穩(wěn)定、特異、敏感的早期診斷標志物，以期達到早期診斷、早期防治AKI，成為降低重癥患者病死率的關鍵。傳統(tǒng)指標如血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及腎小球濾過率(eGFR)由于所受影響因素較多，不夠敏感，作為腎損傷的標志物并不能令人滿意。目前臨床仍然主要以Scr作為AKI的診斷依據(jù)，但是Scr受年齡、性別、體質量、藥物、容量負荷、肌肉代謝、蛋白攝入等諸多非腎臟因素的影響，結果并不可靠。尿量作為傳統(tǒng)指標也面臨與Scr類似的問題。體內外研究發(fā)現(xiàn)，腎近曲小管細胞在損傷后可高表達中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)，腎臟皮質小管、血液和尿液中均有NGAL的大量堆積，提示血NGAL和尿NGAL對AKI具有早期診斷價值。

NGAL(中性粒細胞明膠酶相關轉運蛋白)是一種小分子質量的分泌蛋白，與明膠酶B(MMP-9)的功能密切相關，可在腫瘤細胞及多種上皮細胞中表達，包括近端腎小管上皮細胞。對腎急性I／R損傷及順鉑誘導的AKI模型進行研究后發(fā)現(xiàn)：在缺血引起的腎損傷中，受損的腎小管上皮細胞能產生大量的NGAL，這些NGAL一方面能誘導腎小管間質中浸潤的中性粒細胞發(fā)生凋亡以保護腎組織免受炎癥細胞的侵害，另一方面還可誘導腎間充質細胞向腎小管上皮細胞的轉化，從而誘導腎小管上皮細胞的再生。在正常腎組織中，NGAL呈低水平表達，當接觸腎毒性物質或發(fā)生缺血性損傷后，皮質腎小管、血液、尿液中會出現(xiàn)NGAL大量蓄積，并可在損傷后3h的尿液和血清中檢測到NGAL，明顯早于尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(中性粒細胞明膠酶)、β2微球蛋白及血肌酐的改變。NGAL還參與腎損傷的修復等。

用膠體金顆粒標記抗體或抗原，以檢測未知抗原或抗體的方法稱免疫膠體金技術。氯金酸(HAuCl₄)在還原劑的作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。該溶液因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。在堿性條件下，膠體金顆粒表面的負電荷與蛋白質的正電荷基團靠靜電引力結合。

由于膠體金的電子密度高，顆粒聚集后呈紅色，因此可用于標記多種大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。除了與蛋白質結合以外，它還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

膠體金免疫層析技術與以往常規(guī)診斷方法相比具有以下突出優(yōu)點：

①快速：全部檢測過程僅需1-3分鐘。

②簡便：不需其它任何儀器設備，操作也極其簡單，可隨時隨地進行。

③可單份檢測：對標本既能成批檢測，又可單份檢測，患者可立刻拿到結果，不必等待。

④穩(wěn)定性好：金標試劑穩(wěn)定，可長期保存。

⑤檢測標本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種人群的檢查。

⑥可向基層醫(yī)療單位推廣：由于具有以上幾個特點，使得本方法既可在大型醫(yī)院使用，又可向基層醫(yī)療單位如：鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、連隊衛(wèi)生所、醫(yī)師診所、甚至家庭推廣使用。

⑦患者可自檢，方法家庭化：如果給試劑盒里配置適當?shù)挠闷罚颊呖梢栽诩依镒詸z。

⑧系統(tǒng)化：該方法易于形成系列化產品，如肝炎系列、性病系列、胃病系列、腫瘤系列等。

膠體金免疫滲透試驗法是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應。膠體金標記抗原(或抗體)檢測相應抗體(或抗原)的免疫學新方法，為研制特異、敏感、快速和便捷的免疫學檢測技術和臨床診斷方法奠定了基礎。金標檢測法在特制的金標板上加入5μL全血、血清或血漿放在檢測儀上2～3min即可得到全定量的結果。