[發(fā)明專利]一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310425798.X
• 申請(qǐng)日: 2013-09-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103446623A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李瑞欣;張西正;盧濤;徐成;侍才洪;郭勇;李昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所;中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/22
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/22;A61L27/60
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 仝林葉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中的組織工程領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是涉及一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

國(guó)內(nèi)外替代動(dòng)物做皮膚刺激實(shí)驗(yàn)的方法為采用組織工程皮膚模型，當(dāng)前歐盟推薦的皮膚刺激性替代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪敲绹?guó)出產(chǎn)的EpiDermTM和法國(guó)生產(chǎn)的EpiSkin模型。模型大多采用膠原凝膠作為組織工程皮膚的支架，其不足主要表現(xiàn)在將細(xì)胞接種到凝膠表面后，細(xì)胞/膠原凝膠復(fù)合物在培養(yǎng)過(guò)程中易收縮，細(xì)胞密度發(fā)生較大變化，所構(gòu)建的組織工程表皮面積也發(fā)生變化，這些不足導(dǎo)致了應(yīng)用此類(lèi)組織工程表皮作檢測(cè)時(shí)存在較大的誤差。此外，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)形成皮膚樣結(jié)構(gòu)后，模型部分收縮，使其邊緣和測(cè)試容器間產(chǎn)生縫隙，當(dāng)進(jìn)行化學(xué)品測(cè)試時(shí)，化學(xué)品溶液易發(fā)生側(cè)面滲漏，也使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大誤差。所以本發(fā)明通過(guò)支架材料的改進(jìn)解決上述兩個(gè)問(wèn)題：支架收縮和化學(xué)品溶液側(cè)面滲漏問(wèn)題。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量占蠶絲的70%～80%，由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸所組成。絲素蛋白具有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，無(wú)致敏和刺激作用，又可部分生物降解，其降解產(chǎn)物本身不僅對(duì)組織無(wú)毒副作用，還對(duì)皮膚等有營(yíng)養(yǎng)與修復(fù)的作用；具有良好的柔韌性和抗拉伸強(qiáng)度、透氣透濕性、緩釋性等，而且經(jīng)過(guò)不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜、凝膠和海綿網(wǎng)狀等。絲素蛋白因其優(yōu)良的性能在組織工程上的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

絲素蛋白生物相容性良好，很多實(shí)驗(yàn)研究表明絲素蛋白可以用來(lái)培養(yǎng)多種細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。眾多實(shí)驗(yàn)證明絲素在體外支持干細(xì)胞的粘附、增殖和分化，體內(nèi)促進(jìn)組織的修復(fù)。因此，絲素蛋白有望在組織工程諸多器官的體外構(gòu)建中用做細(xì)胞支架材料，如組織工程化皮膚、軟骨、肌腱、血管等。Min?等采用靜電紡技術(shù)制成的絲素納米纖維多孔支架，平均孔徑為80?nm，在此材料上培養(yǎng)人體角質(zhì)細(xì)胞?(Human?keratinocytes)?和成纖維細(xì)胞(Fibroblasts)?效果良好。電鏡照片顯示，培養(yǎng)3?d后角質(zhì)細(xì)胞在絲素納米纖維材料表面黏附生長(zhǎng)，并沿孔擴(kuò)散到內(nèi)層，且細(xì)胞之間以及細(xì)胞與周?chē)w維之間作用良好；7天后，細(xì)胞沿纖維方向生長(zhǎng)并形成三維網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)胞層結(jié)構(gòu)。絲素蛋白對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，由絲素蛋白制成的絲素膜是一種良好的創(chuàng)面覆蓋物。呂國(guó)忠等觀察到成纖維細(xì)胞能夠在絲素蛋白納米纖維中不斷伸展、黏附、擴(kuò)增，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，14?天后成纖維細(xì)胞與支架及細(xì)胞所分泌的基質(zhì)融為一體，整個(gè)支架表面均被成纖維細(xì)胞及基質(zhì)成分所覆蓋，形成活性支架。

以上充分說(shuō)明了絲素蛋白具有良好的細(xì)胞相容性，但單純的絲素蛋白存在一定的缺陷，例如純絲素材料在含水量極低時(shí)容易破碎，在低濕環(huán)境應(yīng)用時(shí)強(qiáng)度不夠，結(jié)晶區(qū)偏少也會(huì)導(dǎo)致絲素材料在溶液中的溶失率較高等；采用靜電紡制備納米絲素膜，環(huán)境要求苛刻、耗時(shí)長(zhǎng)，如果用于規(guī)?；a(chǎn)還存在一定困難，以上所述使絲素在某些應(yīng)用中受到限制，因此通過(guò)復(fù)合材料性能互補(bǔ)的原理有望制備綜合性能良好的組織工程皮膚支架。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有皮膚模型在培養(yǎng)過(guò)程中易發(fā)生收縮和邊緣易發(fā)生檢測(cè)液滲漏等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明一種組織工程表皮模型的構(gòu)建方法，?按照下述步驟進(jìn)行：

A.選用熱塑性無(wú)紡布，通過(guò)熱壓方法將其制備成圓盤(pán)狀支架；

B.以桑蠶絲為原料，通過(guò)脫膠、溶解、透析和濃縮制備絲素蛋白溶液；

C.用制備的絲素蛋白溶液對(duì)圓盤(pán)狀無(wú)紡布支架進(jìn)行浸潤(rùn)，絲素溶液濃度為2~10%，然后進(jìn)行真空干燥和無(wú)水乙醇后處理；

D.接種人表皮細(xì)胞株Hacat，Hacat細(xì)胞的接種密度為10⁴~10⁵/ml，氣液面培養(yǎng)，待增殖形成片層結(jié)構(gòu)即構(gòu)建成組織工程表皮模型。

選用的無(wú)紡布的原料為聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺中的一種或幾種。將無(wú)紡布熱壓成圓盤(pán)狀支架的溫度為130～200℃，圓盤(pán)直徑為5mm～30mm，圓盤(pán)邊緣高度為0.5mm～3mm。

絲素脫膠采用以下任一方法進(jìn)行：浸泡于Na₂CO₃的水溶液中，溫度為60-100℃；或浸泡于中性皂的水溶液中，溫度為90-100℃；或浸泡于去離子水中在溫度為110-130℃，壓力為0.05-0.18MPa條件下脫膠。