[發(fā)明專(zhuān)利]大腸埃希氏菌O104：H4多重PCR檢測(cè)引物組和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310425555.6
• 申請(qǐng)日: 2013-09-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103451306A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉艷;王雷;張志強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京卓誠(chéng)惠生生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 穆宏平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及大腸埃希氏菌O104：H4多重快速PCR檢測(cè)引物組和試劑盒。

背景技術(shù)

2011年5月，德國(guó)發(fā)生由大腸埃希氏菌O104：H4引起的暴發(fā)疫情，并波及歐盟其他13個(gè)國(guó)家及美國(guó)、加拿大等地。由于導(dǎo)致此次疫情的大腸埃希氏菌的血清型比較罕見(jiàn)，人群普遍易感，疫情快速蔓延。直至當(dāng)年7月疫情終止，共報(bào)告大腸埃希氏菌O104：H4感染病例4400余例。

感染大腸埃希氏菌O104：H4的臨床表現(xiàn)主要有腹部絞痛和腹瀉，一些病例為血便樣腹瀉。多數(shù)患者10天內(nèi)康復(fù)，少數(shù)患者，可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如以急性腎功能衰竭、溶血性貧血和血小板減少為特點(diǎn)的溶血尿毒綜合癥(HUS)。隨訪發(fā)現(xiàn)感染O104：H4的預(yù)后較差，20%的感染者轉(zhuǎn)化為HUS。一旦發(fā)生HUS，病死率將顯著增高。

此次引發(fā)疫情的大腸埃希氏菌O104：H4菌株與以往發(fā)現(xiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌都不一樣，是一種新發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)毒力的大腸埃希氏菌新變種。對(duì)O104：H4全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，O104：H4是腸出血性大腸埃希菌（EHEC）和腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）重組產(chǎn)生的新菌株。O104：H4既含有EAEC中介導(dǎo)集聚性黏附的aggR，又含有EHEC中可導(dǎo)致HUS的志賀樣毒素2（stx2）。但與EHEC致病相關(guān)的其他毒力基因，如粘附因子基因eaeA、志賀樣毒素1（stx1）在O104：H4中均未發(fā)現(xiàn)。其中，eaeA介導(dǎo)菌體粘附，stx1和stx2的致病機(jī)制類(lèi)似。

新型的大腸埃希氏菌O104：H4兼具有EAEC和EHEC的基因特性，因此具有更大危害性。O104：H4中含有的aggR，可使菌體在腸細(xì)胞表面產(chǎn)生集聚性黏附，抑制吸收，產(chǎn)生腹瀉。同時(shí)其攜帶的志賀樣毒素2（stx2），造成腸黏膜上皮細(xì)胞破壞、黏膜潰瘍、出血，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、溶血、血小板減少。更嚴(yán)重的是，腎小管上皮細(xì)胞壞死、堵塞和腎小球破壞，引發(fā)溶血性尿毒綜合征（HUS）和出血性結(jié)腸炎（HC）。嚴(yán)重者可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，導(dǎo)致感染患者死亡。

O104：H4型大腸埃希氏菌主要通過(guò)被污染的食物傳播，根據(jù)既往的經(jīng)驗(yàn)，在歐美等國(guó)，被污染的碎牛肉餡和未經(jīng)消毒的奶制品是一個(gè)重要的傳染源，被污染的一些農(nóng)產(chǎn)品也可以成為傳染源。

研究表明O104：H4在人群中暴發(fā)之前，已經(jīng)在動(dòng)物間傳播達(dá)10年之久。因此開(kāi)展O104：H4的主動(dòng)檢測(cè)，對(duì)潛在的EAEC和EHEC的新型重組模式進(jìn)行探索，建立有效的暴發(fā)預(yù)警機(jī)制，對(duì)O104：H4和新型重組致病菌感染的防控有重大意義。

采用傳統(tǒng)方法鑒定O104：H4，如增菌培養(yǎng)、生化鑒定和血清凝集，需要在增菌富集后采用生化方法確定是大腸埃希氏菌，用血清凝集方法確定其O抗原和H抗原。但確定一株大腸埃希氏菌是O104：H4血清型后，因不清楚其毒力基因攜帶情況，仍不能判定該株菌是否為致病菌，無(wú)法確定檢出是否有意義。且傳統(tǒng)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果受血清質(zhì)量和主觀判斷影響大。

除了傳統(tǒng)方法外，已建立了一些分子生物學(xué)的檢測(cè)方法。歐盟的大腸埃希氏菌參比實(shí)驗(yàn)室推薦使用單重實(shí)時(shí)熒光對(duì)stx2、rfb_O104和fliC_H4基因逐個(gè)篩查（Detection?and?identification?of?Verocytotoxin-producing?Escherichia?coli(VTEC)O104:H4in?food?by?Real?time?PCR）。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110376158.5公開(kāi)了一種致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，通過(guò)一個(gè)反應(yīng)，可以從標(biāo)本中檢出O157：H7、和O104：H4血清型的大腸埃希氏菌的存在，但只能確定是否是O104：H4血清型的大腸埃希氏菌，并不能判定該菌是否是致病株。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210068180.8公開(kāi)了腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測(cè)試劑盒及其使用方法，通過(guò)熒光定量PCR，檢測(cè)是否含有wzy（O104）、fliC(H4)和aggR基因，從而判斷待測(cè)細(xì)菌為腸出血性大腸桿菌O104:H4。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110197208.3公開(kāi)了一種腸出血性大腸桿菌O104:H4的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，檢測(cè)志賀樣毒素2型基因（stx2），O抗原翻轉(zhuǎn)酶基因（wzx）和H4鞭毛抗原基因（fliC_H4），若Stx2、wzx和fliC_H4均呈陽(yáng)性，則判斷待測(cè)細(xì)菌為腸出血性大腸桿菌O104:H4。