[發明專利]微流體細胞處理芯片及其應用方法

無效

• 申請號: 201310425428.6
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103451090A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 周新麗;周楠峰;楊云;李維杰
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;A01N1/02
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 吳寶根;王晶

技術領域

本發明涉及一種微流體細胞處理芯片，具體說，是涉及一種以對細胞損傷小，操作簡便顯著，在低溫保護劑的加載和去除過程中，能使低溫保護劑濃度連續改變的微流體芯片及其應用方法。

背景技術

????細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。細胞凍存時向培養基中加入保護劑--終濃度5％~15％的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。

????卵母細胞作為一種體積較大的動物生殖細胞，它的低溫保存技術是人類輔助生殖領域的重要工具。通過對健康的卵母細胞進行低溫保存，將能夠為需要的人提供更多的生育機會。在低溫保存過程中不可避免的要使用低溫保護劑，低溫保護劑的使用也會帶來許多副作用：一方面低溫保護劑添加和去除過程中，由于滲透壓的急劇變化，大量水或低溫保護劑快速流出或流入細胞，從而引起細胞體積的膨脹或收縮，造成細胞膜結構和細胞骨架系統的損傷；另一方面低溫保護劑對細胞有化學毒性損傷，并且其毒性大小隨作用時間和作用濃度的增加而增大。目前通常采用分步添加和分步去除保護劑的方法。這種方法操作步驟繁瑣，要求在很短的時間內在顯微鏡下準確找到細胞，并完成細胞在溶液間的轉移，非常容易造成細胞的丟失，對操作人員的熟練程度要求很高；而且分步添加和分步去除的次數也不可能增加太多，這就使卵母細胞仍然會受到幾次由于保護劑濃度突然變化造成的體積突然變化，且在高濃度低溫保護劑中的暴露時間長。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的之一是提供一種使低溫保護劑濃度連續變化的微流體細胞處理芯片。

本發明的目的之二是提供一種將微流體細胞處理芯片在卵母細胞低溫保護劑加載和去除中的應用方法。

本發明的技術方案：一種微流體細胞處理芯片，由底層和頂層構成，其特點是：頂層中設有蛇形管道和細胞操作腔、蛇形管道的溶液流入口上設有兩個流入通道，兩個流入通道的入口管道上分別設有保護劑入口和緩沖溶液入口，蛇形管道的溶液流出通道連接細胞操作腔，細胞操作腔設有溶液出口和細胞進出口通道，細胞進出口通道上裝有轉矩控制微閥，細胞操作腔的兩側各設有一個半隔斷。

保護劑入口和緩沖溶液入口對稱于蛇形管道的溶液流入口，保護劑入口和緩沖溶液入口的開口直徑相同；并且分別通過第一微流體芯片毛細管與一個雙通道注射泵的兩個注射器連接；入口管道的徑高比為1:4~1:5。。

細胞操作腔為上凹的長方體，其容積為0.1~0.2mm3。

溶液出口連接第三微流體芯片毛細管，微流體芯片毛細管上設有溶液出口開關。?

蛇形管道的橫截面為正方形，其邊長d=0.05~0.2mm，相鄰管道間距=0.2~0.3mm，蛇形管道的總長度為1.5~2.5cm。

半隔斷為凸形扁平長方體，其與底層的間隙高度為30~40μm。

底層材質為玻璃基片，頂層材質為聚二甲基硅氧烷；細胞進出口通道上面設有半徑4mm，深2mm的聚氨酯層，該聚氨酯層面積為所述頂層面積的0.3%~0.5%，聚氨酯層中間連接轉矩控制微閥。

由底層和頂層構成的所述芯片的長：寬：高=60~80：45~55：1~3。?

一種微流體細胞處理芯片的應用方法，包括低溫保護劑加載方法和低溫保護劑去除的方法：

低溫保護劑加載方法的步驟為：

a)?打開轉矩控制微閥和溶液出口開關，用移液器將細胞及緩沖溶液注入與細胞進出通道入口連接的第二微流體芯片毛細管，將一注射器連接第二微流體芯片毛細管，推動注射器使得細胞進入細胞操作腔；

b)?關閉轉矩控制微閥，打開雙通道注射泵中的低溫保護劑注射器和緩沖溶液注射器，緩慢增加低溫保護劑的流速，緩慢減小緩沖溶液的流速，使得混合后的溶液中低溫保護劑的濃度連續增加；?

c)?在對細胞低溫保護劑加載的同時，用顯微鏡觀察細胞體積的變化；

d)?當細胞達到處理要求后，關閉兩個注射器，打開轉矩控制微閥，關閉溶液出口開關；

e)?打開低溫保護劑注射器，使得細胞從細胞操作腔經細胞進出通道沖出芯片，加載過程完畢。

低溫保護劑去除的方法步驟為：