[發明專利]表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株

無效

• 申請號: 201310423137.3
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103509727A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 李多川;韓超
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
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• 代理人: 暫無信息

（一）技術領域

本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株Pichia?pastoris?GS-CT-9C。?

（二）背景技術

糖苷水解酶（英語：Glycoside?hydrolases，又稱糖苷酶）是一種專門水解配糖鍵（glycosidic?bond），并產生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。?

嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50℃條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和9家族糖苷水解酶。?

嗜熱毛殼菌產生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用,可使其活性提高1.4倍。在不同金屬離子如Mn²⁺的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分別提高15倍和3.5倍。?

（三）發明內容

本發明從嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum獲得內切β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全長，命名為CtAA9c，CtAA9c基因DNA全長1020bp，包括信號肽序列，起始密碼子和終止密碼子，無內含子，編碼313個氨基酸，具有信號肽序列（1-26aa?MPPSTSSLLSILLTLSSTLIPDPVFA）。將CtAA9c編碼的氨基酸序列在?國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第9家族。?

構建重組表達質粒載體pPIC9K/CtAA9c，利用電轉儀進行電擊轉化Pichia?pastoris?GS115，在MD和MM培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9C。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28℃200rpm/min搖床培養6d后，糖苷水解酶的表達量為3.24mg/ml，分子量為65KDa，酶活力為0.0483U/ml，CtAA9C在65℃下是穩定的，處理60min后仍有95%以上的酶活性；70℃處理30min后仍保持74.4%的活性；80℃處理30min后保持24.8%的活性；90℃處理30min活性幾乎完全喪失。?

9家族糖苷水解酶CtAA9C對嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高1.4倍。不同金屬離子對CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn²⁺條件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纖維素酶活性可分別提高35倍和3.5倍。?

（四）附圖說明：

圖1?9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析?

泳道1：低分子量蛋白標準?

泳道2：純化的9家族糖苷水解酶CtAA9C?

圖2?A:9家族糖苷水解酶CtAA9C的最適溫度?

B:9家族糖苷水解酶CtAA9C的熱穩定性測定?

圖3??9家族糖苷水解酶CtAA9C對內切纖維素酶N24活性的促進作用?

圖4??金屬離子Mn²⁺對CtAA9C纖維素酶及混合酶活性的影響?

（五）具體實施方式

實施例1：嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum的分離鑒定?

（1）標本采集：從堆肥中采集。?

（2）分離培養：將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50℃培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney?and?Emerson(1964)文獻。?

（3）鑒定:參考Cooney?and?Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻。?

實施例2：糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆?

（1）嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum總RNA的提取：參照Trizol試劑盒說明。?