[發明專利]優化Savinase高效分泌表達的信號肽及其應用

有效

• 申請號: 201310422659.1
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103483432A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 王建暉;馬坤;汪慶萍
• 申請（專利權）人: 廣州吉格生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/32
• 分類號: C07K14/32;C12N15/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種優化Savinase高效分泌表達的信號肽及其應用。?

背景技術

隨著人們對產品安全性要求的日益增長，生物酶制劑在食品加工、化合物酶法合成以及加酶洗滌劑等重大領域扮演著愈加重要的角色。?

枯草芽孢桿菌作為一個通常被認為是安全(GRAS，generally?regarded?as?safe)的菌種，由于其低廉的發酵成本與優良的蛋白分泌水平(可高達20-25g/L酶)，在生物酶制劑領域有著廣泛的應用。目前，60%的商業用酶的宿主均來自于芽孢桿菌屬。?

其中，Savinase是以枯草芽孢桿菌作為宿主發酵的一種主要酶類。Savinase來自于嗜堿芽孢桿菌，是基因PB92成熟肽的商品名。?

PB92基因由信號肽、前肽與成熟肽三部分組成。基因經過翻譯形成前體蛋白后，其中信號肽部分通過與SRP等元件的結合，將PB92基因翻譯蛋白引導至細胞膜處分泌，并在分泌過程中完成對信號肽的變構與剪切，并最終與前肽和成熟肽的融合蛋白分離。在周質空間處，每兩個PB92前肽與成熟肽融合蛋白形成復合體，相互對對方的前肽進行剪切，前肽在此過程中幫助成熟肽完成折疊，最終形成有活力的成熟肽——Savinase。?

Savinase在多方面具有良好的性能，其比酶活高達190U/mg，無明顯致敏性；最適pH為10.5，適合用于廣泛使用的堿性洗滌劑；耐受溫度為55℃，適用于常溫使用，且在4℃能夠存放較長時間；此外，savinase在枯草芽孢桿菌中獲得良好的表達，經過高密度發酵，能夠達到1-2g/L的水平，具有良好的工業應用前景。目前，對于savinase的生產成本的優化，主要體現在savinase的產品優化以及其分泌優化上。對于savinase的產品優化，現主要集中在突變體的構建以及保護劑的添加。對于savinase的分泌上，主要集中在啟動子的優化，mRNA稀有密碼子的去除，二級結構的優化，mRNA?stablizer的添加、核糖體的優化以及高密度發酵工藝的優化。?

在savinase被發現后近40年間，針對savinase性質改良的專利文獻逐漸增加，尤其在savinase的三維結構解析后，通過相應位點的半理性突變獲得相應性質改良，如獲得提高耐受自裂解、耐受過氧化氫以及與脂肪酶和諧共處的突變體變得可行。然而篩選出來的突變體雖然性質發生優化，但是綜合性能仍然無法和野生型savinase相比，且可能導致分泌難度的增加，最終導致生產成本的提升；為了降低savinase的實際使用成本，諾維信novozyme公司也在劑型的改良上進行了嘗試。通過添加硼酸鹽衍生物作為穩定劑，有效的提高了savinase的儲存時間，并對酶活沒有明顯的影響，最終開發出高濃度ultra?savinase?16xL的產品，成為加酶洗滌劑的主要添加成分。然而硼酸鹽衍生物作為潛在毒性物質，長期使用將對人體造成慢性中毒以及對相應環境造成污染，制約了savinase包括洗滌劑等領域的進一步應用。因而，仍需開發新型無毒穩定劑。?

為了進一步提高savinase的工業應用價值，人們嘗試對其生產條件進行優化，以其降低實際使用成本。而Savinase作為在枯草芽孢桿菌優良分泌表達蛋白種類，對于其產量提升，主要集中在對于啟動子、mRNA二級結構以及高密度發酵工藝的改良。然而，過強的啟動子、過剩的外源蛋白胞內積累，形成包涵體或者造成分泌通道的阻塞，進而導致菌體生長不良以及分泌蛋白量的下降，風險較大；高密度發酵的工藝經過多次的改良，具有一定的發展潛力，但是由于工藝成熟，不容易在行業中獲得較大的優勢。因而現在savinase的價格仍然維持在較高水平，這制約了savinase的進一步大規模使用。?

通過改變信號肽實現異源蛋白的分泌優化是一項常見的技術，Savinase對應的信號肽是嚴格Sec?途徑依賴型的信號肽，作為常用的異源蛋白在枯草芽孢桿菌分泌表達的信號肽，Savinase對應的信號肽能夠不同程度改變異源蛋白在枯草芽孢桿菌的分泌表達，隨著人們對芽孢桿菌分泌蛋白種類認識的加深，人們開始嘗試大規模篩選針對特定蛋白具有分泌優化性質的信號肽。?