[發明專利]一種以釀酒酵母孢子為載體的固定化酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310422568.8
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103436520B
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 中西秀樹;高曉冬;張海妮;李子杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/16
• 分類號: C12N11/16;C12N15/09
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種以釀酒酵母孢子為載體的固定化酶的制備方法，其特征在于：包括，

釀酒酵母單菌落的培養，采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母 SK1孢子壁最外層二酪氨酸層的DIT1基因，將得到的釀酒酵母缺陷菌株在 YPAD固體培養基平板上劃線，28℃～32℃培養至長出單菌落；

孢子的制備，挑取單菌落到YPAD液體培養基中，搖床培養后，將菌液轉 接到YPAce培養基中，培養后收集細胞，轉到1％～3％的醋酸鉀溶液中培養，使 得醋酸鉀溶液中細胞的濃度為2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后離心，將離心后的釀 酒酵母菌體用PBS緩沖液洗滌，在36℃～38℃下用一定量的lyticase處理0.5h～1.5 h后，進行超聲波破碎，得到游離狀態的釀酒酵母孢子并對釀酒酵母孢子進行純 化和冷凍干燥，所述孢子的制備，YPAce培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白 胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸餾水中，121℃滅菌15min后，補加 100mL單獨滅菌的20％醋酸鉀；

酶的固定化，將β-半乳糖苷酶固定到釀酒酵母DIT1基因缺陷型的孢子上， 將經純化的釀酒酵母△dit1孢子，用2％～3％的戊二醛溶液進行處理，然后洗滌 釀酒酵母孢子，向釀酒酵母孢子中加入配制好的β-半乳糖苷酶溶液，在3℃～5℃ 下進行固定，離心，洗滌，得到固定化的β-半乳糖苷酶。

2.根據權利要求1所述的以釀酒酵母孢子為載體的固定化酶的制備方法， 其特征在于：所述釀酒酵母單菌落的培養，YPAD固體培養基的配制為酵母提取 物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，瓊脂20g，定容于900mL蒸餾水中，121℃ 滅菌15min后，補加100mL單獨滅菌的20％葡萄糖。

3.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：所述對 釀酒酵母孢子進行純化，包括，

配制Percoll溶液，將處理過的細胞用0.5％Triton?X-100溶液洗滌，以除去 其中的裂解酶等雜質，然后將細胞懸浮在0.5％Triton?X-100溶液中，配制不同梯 度50％～80％不同濃度梯度的Percoll溶液；

釀酒酵母孢子的純化，將所述Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入 到離心管中，最后加釀酒酵母細胞懸浮液，離心，將上層液體除去，得到純化 的釀酒酵母孢子。

4.一種采用如權利要求1～3任一方法制備的以釀酒酵母孢子為載體的固定 化酶，其特征在于：所述固定化酶是將β-半乳糖苷酶固定化到不含有二酪氨酸層 的釀酒酵母缺陷型孢子上。