[發(fā)明專利]大蒜種質(zhì)資源RAPD遺傳多樣性分析方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310422230.2
• 申請(qǐng)日: 2013-09-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103484545A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)明;陳堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種篩選大蒜種質(zhì)的方法，特別涉及一種利用RAPD方法篩選大蒜種質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

中亞地區(qū)是大蒜的原產(chǎn)地，該地區(qū)大蒜品種多樣，是最重要的大蒜進(jìn)化中心^[17,20,111]。新疆地處中亞，其地產(chǎn)大蒜與內(nèi)地省市大蒜的蒜氨酸含量差異顯著^[112]，新疆境內(nèi)不同品種大蒜的蒜氨酸含量也有差異^[113]，但根據(jù)外觀性狀難以區(qū)別鑒定。近年來(lái)，新疆已有種植戶從異地盲目引種，導(dǎo)致品種退化，蒜氨酸含量明顯下降，但對(duì)這些品種也無(wú)法通過(guò)外觀性狀進(jìn)行鑒定，對(duì)大蒜栽培和育種工作造成困難，也嚴(yán)重威脅新疆優(yōu)質(zhì)大蒜的品質(zhì)。因此，對(duì)新疆地產(chǎn)大蒜進(jìn)行分子鑒定，開(kāi)展遺傳多樣性研究，了解大蒜間的親緣關(guān)系，區(qū)別種質(zhì)的優(yōu)劣非常必要。

國(guó)外學(xué)者主要采用RAPD、AFLP及同工酶標(biāo)記對(duì)西歐、美洲等地的大蒜進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析^{[55,57，114]}。國(guó)內(nèi)學(xué)者則主要采用RAPD和ISSR及同工酶標(biāo)記對(duì)大洋洲、亞洲部分國(guó)家和我國(guó)部分內(nèi)地省市的大蒜進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳特性的分析和鑒定^[60-64]。針對(duì)新疆主要栽培區(qū)的大蒜種質(zhì)資源尚未開(kāi)展分子水平上的研究。

作為一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，RAPD是由美國(guó)科學(xué)家Williams于1990年研究提出的^[115]，具有簡(jiǎn)便、快速、多態(tài)性好等特點(diǎn)^[116]，是一種快速靈敏的分子標(biāo)記，已廣泛運(yùn)用于多種植物的種內(nèi)和種間遺傳多樣性研究和種性鑒定，并表現(xiàn)出了很強(qiáng)的多態(tài)性^[117-121]，也已應(yīng)用于蔥屬品種遺傳關(guān)系的分析^[122-124]及大蒜品種遺傳多樣性分析^{[57,60,62-64,114]}。RAPD技術(shù)對(duì)反應(yīng)條件比較敏感，重復(fù)性較差，許多研究表明，采用優(yōu)化的反應(yīng)體系可獲得穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的RAPD譜帶^[125-127]，因此，需要篩選和確定該標(biāo)記技術(shù)對(duì)于供試材料的最佳PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)程序，建立具有高度重復(fù)性和穩(wěn)定性的反應(yīng)體系。

本實(shí)驗(yàn)采集新疆主要栽培區(qū)不同居群及部分內(nèi)地傳統(tǒng)種植省區(qū)的大蒜樣品，采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行大蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究；包括提取大蒜基因組DNA，探討RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)于大蒜的適用性，建立和優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系，獲取并科學(xué)分析多態(tài)性RAPD譜帶，構(gòu)成遺傳相似系數(shù)矩陣，進(jìn)行遺傳多樣性的聚類分析；旨在闡明新疆大蒜與內(nèi)地省區(qū)大蒜以及新疆主要栽培區(qū)不同品種大蒜之間的親緣關(guān)系，為大蒜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供依據(jù)，為藥用大蒜優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的篩選奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用RAPD方法分析大蒜的遺傳多樣性進(jìn)而篩選大蒜種質(zhì)的方法，所述方法步驟簡(jiǎn)便、試劑相對(duì)便宜、擴(kuò)提取效果優(yōu)，重復(fù)性好。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種利用RAPD方法分析大蒜的遺傳多樣性進(jìn)而篩選大蒜種質(zhì)的方法，包括以下具體步驟：

1、大蒜基因組DNA的提取

(1)用潔凈剪刀剪取大蒜嫩苗(優(yōu)選離尖端約2cm)，并用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸去材料表面的水分。

(2)稱取幼嫩葉片約0.2g，置于經(jīng)液氮冷凍的研缽中，小心加入液氮，充分研磨至粉末狀。

(3)用經(jīng)滅菌的不銹鋼勺將粉末裝入離心管，加65℃預(yù)熱的質(zhì)量濃度為2％CTAB分離緩沖液2.0ml，65℃水浴中放置30min，期間混勻3次。

(4)放冷后，加入等體積氯仿-異戊醇(氯仿：異戊醇的體積比為24：1)，小心顛倒離心管2～3次，混勻，10000r／min離心10min。

(5)轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新管中，并加入氯仿600μl，小心顛倒離心管2～3次，混勻，10000r/min離心10min。

(6)轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新管中，并加入2倍體積無(wú)水乙醇，置于-20℃冰浴20min，10000r／min離心10min，棄去上清。

(7)加入體積比為75％乙醇1ml清洗沉淀，10000r／min離心5min，離心，棄去上清，再次離心，吸除剩余乙醇，室溫下將DNA自然干燥10min。

(8)加入50μl?TE緩沖液，渦旋促進(jìn)DNA溶解。

(9)置于-20℃貯存。

2、DNA濃度和純度的檢測(cè)