[發明專利]一種微小RNA啟動子活性檢測的方法

有效

• 申請號: 201310421926.3
• 申請日: 2013-09-17
• 公開（公告）號: CN103484544A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 徐林;周涯;廖珍媛;李永菊;羅軍敏
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，該微小RNA啟動子活性檢測的方法包括以下步驟：

步驟一、首先通過GeneBank獲得miRNA前段5’端-1064位點到其3’端側翼+124位點的序列，通過Primer5設計對應引物；根據無啟動子、增強子的真核載體pGL3.0-Basic的MCS區的酶切位點，篩選并在引物上游和下游分別引入酶切位點XhoI和BgIII；接下來抽取人肺癌95D細胞的DNA，利用PCR實驗，通過引物擴增目的片度，常規純化目的片度后，經XhoI和BgIII雙酶切、純化，與同樣經XhoI和BgIII雙酶切、純化的真核載體進行連接；30分鐘后，將連接產物轉化DH5a感受態細胞，常規涂板后，放置37°培養箱培養12小時；挑選單個陽性克隆，在Amp+LB培養基中培養12小時，進行菌液PCR、酶切和測序鑒定；

步驟二、將構建成功的重組真核載體抽提，鑒定純度和濃度后，-80℃保存；常規培養人肺癌95D細胞，按5×10⁴個細胞鋪于24孔板中，將10ug重組載體和對照載體體外分別利用Lipofectamine2000瞬時轉染細胞后，繼續在5％CO₂，37℃條件下培養，48小時后，抽取各組細胞總RNA，利用Realtime?PCR探針法檢測miRNA表達水平；

步驟三、通過體外實驗觀察啟動子表達miRNAs后的生物學效應；利用MTT實驗檢測各轉染組中95D細胞生長的變化。

2.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟一中真核載體是pGL3.0-Basic。

3.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟二中miRNA是miR-7。

4.如權利要求1所述的微小RNA啟動子活性檢測的方法，其特征在于，步驟二中重組真核載體是pGL3.0-Basic-miR-7-promoter。