[發明專利]一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法

在審

• 申請號: 201310421008.0
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104458708A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 嚴明;張陸勇;胡潔;高鵬
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥理學領域，利用熒光檢測技術，構建了乙酰膽堿酯酶抑制劑的高通量篩選模型，用于待測樣品對乙酰膽堿酯酶抑制活性的高通量檢測。

背景技術

乙酰膽堿酯酶抑制劑，與乙酰膽堿(ACh)一樣，也能與膽堿酯酶(AChE)結合，但是結合比較牢固，水解較慢，使AChE不能再與ACh結合，從而導致膽堿能神經末梢釋放的ACh不能及時被AChE分解，造成堆積，產生擬膽堿作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑在臨床上用于治療重癥肌無力、術后腸脹氣，及眼科用藥。因此篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑在臨床上有一定意義。

實驗中利用乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶作用下水解成膽堿，再經過膽堿氧化酶的作用生成過氧化氫，生成的過氧化氫與Amplex?Red?reagent在辣根過氧化酶作用下會產生帶有熒光的產物試鹵靈，通過熒光強弱來判斷乙酰膽堿酯酶作用，從而得出化合物是否有乙酰膽堿酯酶抑制作用。

目前，已有多種乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選方法，多利用吸光度來篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準確的檢測方法，特別是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。

發明內容

本發明的目的在于建立一種基于熒光的乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。

本發明的技術方案：采用熒光方法建立體外乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型，初篩，復篩發現一類具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的候選化合物。具體步驟如下：

本發明利用熒光的方法建立了一種乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選模型。

步驟一：乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型的建立與優化。

步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。

步驟三：高通量篩選模型驗證。

附圖說明：

圖1：乙酰膽堿濃度梯度優化實驗結果。

圖2：乙酰膽堿酯酶濃度梯度優化實驗結果。

圖3：陽性藥他克林對乙酰膽堿酯酶的抑制曲線圖。

圖4：高通量篩選Z′值分布。

具體實施方式

以下結合附圖說明本發明的具體實施方式：

一、乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選方法建立

1、實驗材料

Amplex?Red?reagent(Invitrogen，USA)、DMSO(Invitrogen，USA)、辣根過氧化酶(Invitrogen，USA)、過氧化氫(Invitrogen，USA)、5×反應buffer(Invitrogen，USA)、膽堿氧化酶(Invitrogen，USA)、氯化乙酰膽堿(Invitrogen，USA)、乙酰膽堿酯酶(Invitrogen，USA)、384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Coming，USA)、一次性槍頭(Axygen，USA)

2、實驗步驟

(1)乙酰膽堿最適濃度確定

1)配制不同濃度的乙酰膽堿，每孔加入20μl。

2)每孔加入20μl1×反應buffer。

3)配制給定濃度的Amplex?Red?reagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯酶，等體積混合，每孔加入40μl。

4)室溫反應1h。

5)檢測熒光強度，確定最適乙酰膽堿濃度(見圖1)。

(2)乙酰膽堿酯酶最適濃度確定

1)配制不同濃度的乙酰膽堿酯酶，每孔加入20μl。

2)每孔加入20μl1×反應buffer。

3)配制給定濃度的Amplex?Red?reagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿，等體積混合，每孔加入40μl。

4)室溫反應1h。

5)檢測熒光強度，確定最適乙酰膽堿酯酶濃度(見圖2)。

(3)陽性藥(他克林)IC₅₀

1)配制不同濃度的他克林，每孔加入20μl。

2)配制最適濃度的乙酰膽堿，每孔加入20μl(空白對照加20μl1×反應buffer)

3)配制給定濃度的Amplex?Red?reagent、辣根過氧化酶、膽堿氧化酶以及最適濃度的乙酰膽堿酯酶，等體積混合，每孔加入40μl。

4)室溫反應1h。

5)檢測熒光強度，計算得出他克林的IC₅₀(見圖3)。

二、數據處理

(1)根據公式計算各孔的相對抑制率