[發明專利]一種以釀酒酵母孢子作為新型吸附劑的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201310420997.1
• 申請日: 2013-09-16
• 公開（公告）號: CN103436481A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 高曉冬;中西秀樹;張海妮;李子杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N15/01;B01J20/00;B01J20/30
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 王愛偉

1.一種釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：包括，

釀酒酵母單菌落的培養，采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母SK1孢子壁最外層二酪氨酸層DIT1基因，將得到的釀酒酵母缺陷菌株在YPAD固體培養基平板上劃線，28℃～32℃培養長出釀酒酵母單菌落；

釀酒酵母孢子的制備，挑取釀酒酵母單菌落到YPAD固體培養基中培養22h～26h，然后將菌液轉接到YPAce培養基中，培養后收集細胞，再轉到濃度為1%～3%的醋酸鉀溶液中培養，使得醋酸鉀溶液中細胞的濃度為2×10⁷/ml～4×10⁷/ml，而后離心，將離心后的釀酒酵母菌體用PBS緩沖液洗滌，在36℃～38℃下用一定量的lyticase處理0.5h～1.5h后，進行超聲波破碎，得到游離狀態的釀酒酵母孢子。

2.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：還包括，對釀酒酵母孢子進行純化和冷凍干燥處理。

3.根據權利要求2所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：所述對釀酒酵母孢子進行純化，包括，

配制Percoll溶液，將處理過的細胞用0.5%Triton?X-100溶液洗滌，以除去其中的裂解酶等雜質，然后將細胞懸浮在0.5%Triton?X-100溶液中，配制不同梯度50%～80%不同濃度梯度的Percoll溶液；

釀酒酵母孢子的純化，將所述Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加釀酒酵母細胞懸浮液，離心，將上層液體除去，得到純化的釀酒酵母孢子。

4.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：所述釀酒酵母單菌落的培養，包括，

引物設計，依據釀酒酵母DIT1基因序列設計引物如下：

上游引物P1

AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAAGCTTTGTCGAGACATTAACAAAACGGATCCCCGGGTTAATTAA

下游引物P2

TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGTAGACCAATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC；

PCR擴增，利用上游引物P1和下游引物P2對質粒pFA6a-His3MX6進行PCR擴增，獲得含釀酒酵母DIT1基因上下游序列的敲除片段；

DIT1基因的敲除，通過醋酸鋰/PEG的轉化方法將PCR擴增得到的his片段分別導入到釀酒酵母SK1的單倍體細胞4B和16D中，并進行篩選；

缺陷性菌株的篩選，將DIT1基因的敲除后得到的轉化菌株涂布到SD-His缺陷性平板上，待長出菌落后，挑取一定數目的菌落提取基因組，并進行PCR驗證，以與野生型菌株的基因組進行對比，若驗證成功，再將單倍體在SD-Leu-Arg平板上融合，得到缺陷性的二倍體菌株；

驗證引物如下：

上游引物：CATAAATTGTGCTCCTCCGC

下游引物：CATTGCAGTGTCTCGAAACC。

5.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：所述釀酒酵母單菌落的培養，YPAD固體培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，瓊脂20g，定容于900mL蒸餾水中，121℃滅菌15min后，補加100mL單獨滅菌的20%葡萄糖。

6.根據權利要求1所述的釀酒酵母孢子的制備方法，其特征在于：所述釀酒酵母孢子的制備，YPAce培養基的配制為酵母提取物10g，蛋白胨20g，腺嘌呤30mg，定容于900mL蒸餾水中，121℃滅菌15min后，補加100mL單獨滅菌的20%醋酸鉀。

7.一種如權利要求1～6所述的釀酒酵母孢子作為金屬離子吸附劑的應用。

8.根據權利要求7所述的釀酒酵母孢子作為金屬離子吸附劑的應用，其特征在于：

將所述釀酒酵母孢子進行純化和冷凍干燥處理后得到釀酒酵母孢子粉末；

將所述釀酒酵母孢子粉末添加至含有金屬離子的溶液中。

9.一種如權利要求1～6所述的釀酒酵母孢子作為脂肪類物質吸附劑的應用。

10.根據權利要求9所述的釀酒酵母孢子作為脂肪類物質吸附劑的應用，其特征在于：

將所述釀酒酵母孢子進行純化和冷凍干燥處理后得到釀酒酵母孢子粉末；

將所述釀酒酵母孢子粉末添加至脂肪類物質中。