[發明專利]甲型H7N9流感病毒(2013)核酸檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310420173.4
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103667522A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 劉濤;夏懿;吳大治
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于第三類醫療器械-分子診斷領域，涉及一種使用熒光RT-PCR方法，結合FRET熒光探針對2013年甲型H7N9流感病毒進行檢測的方法及試劑盒。

背景技術

H7N9型禽流感是用一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發現。H7N9型禽流感是全球首次發現的新亞型流感病毒，至2013年4月初尚未有疫苗推出。被該病毒感染均在早期出現發熱等癥狀，至2013年4月尚未證實此類病毒是否具有人傳染人的特性。2013年4月經調查，H7N9禽流感病毒基因來自于東亞地區野鳥和中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配。

國家衛生和計劃生育委員會發布的人感染H7N9禽流感診療方案（2013年第2版）指出，人感染H7N9禽流感潛伏期一般為7天以內。患者一般表現為流感樣癥狀，如發熱，咳嗽，少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病?情發展迅速，表現為重癥肺炎，體溫大多持續在39?以上，出現呼吸困難，可伴有咳血痰；可快速進展出現急性呼吸窘迫綜合征、縱隔氣腫、膿毒癥、休克、意識障礙及急性腎損傷等。

核酸檢測（nucleic?acid?testing，NAT）是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱，可在尚未檢測到抗原或抗體前，先檢測到病毒核酸，其基本步驟包括核酸提取、擴增和檢測。也就是常說的基因檢測，是通過血液、其他體液或細胞對?DNA進行檢測的技術，可以診斷疾病，也可以用于疾病風險的預測。由于核酸檢測是直接檢測病原體核酸，具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優點，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。?核酸檢測技術已經從定性檢測發展到實時熒光定量檢測。針對有些臨床需要，除能夠依據陰陽性判斷確證病例以外還可以依據核酸的載量判斷感染程度。

檢測設備根據國家標準，H7N9禽流感病毒的核酸檢測采用的熒光RT-PCR檢測需要實時熒光定量PCR儀用于定量檢測，或PCR基因擴增儀用于定性檢測，以及依據H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探針的PCR檢測試劑盒。

2013年4月2日，國家CDC?已經啟動應急程序，將檢測H7N9禽流感病毒的核酸檢測PCR試劑探針及引物下發至各地方CDC和各個診斷實驗室，以保證H7N9的準確診斷。

在此基礎上，我們開發了一種檢測2013年甲型H7N9流感病毒進行檢測的方法及試劑盒，該試劑盒利用RT熒光PCR對2013年甲型H7N9流感病毒進行特異性的檢測。

發明內容

1、本發明目的在于提供一種方法和試劑盒，這種試劑盒可以檢測特異性的檢2013年甲型H7N9流感病毒。

2、本試劑盒提供的方法可以在2管內完成2013年甲型H7N9流感病毒檢測，加樣后全程閉管檢測，不需要開蓋檢測，極大的降低了實驗室污染情況，而且操作簡單。

3、本試劑盒引物設計使用MAP引物設計方法，將引物分為三段式引物，其中3~8個次黃嘌呤可以在序列的特定位置。

4、引物設計：引物設計使用MAP三段引物設計方法，其中n代表次黃嘌呤。

SEQ?ID?NO:1：GAGTCTGCTGCTAGnnnnnCAACAGG??

SEQ?ID?NO:2：GTCTGAAACCATACCnnnnnAACCATC

SEQ?ID?NO:3：GRGCTGCAATTGCnnnnnTCACACT

SEQ?ID?NO:4：CTTCCATTTGGATGTTnnnnnGGTGATGT

5、探針設計：SEQ?ID?NO:5:?GTTCCTGAGATTCCAAAGGGAAGAGGCCTA

SEQ?ID?NO:6:?CCTGAAACAACCAACACAAGCCA

本試劑盒采用單獨的非競爭性模板作為內參設計區域，這樣可以使引物之間的配合更好，不相互干擾，這種引物設計采取獨特的環形引物設計，具體方法為在非競爭引物5’末端增加一段互補序列，成環的tm值要低于退火溫度，這樣當退火溫度以下時。

6、固體反應物制備：

反應體系和固體反應物的制備：每人份反應物包括正向引物每種為0.4μM，負向引物濃度為10μM,?2ul?dUTPs?(2.5?mM?of?each?dUTP),??5mM?MgCl2,1.5U熱啟動聚合酶，0.2U焦磷酸酶、0.2U?UNG酶、10%的海藻糖，1%的甘油，每種熒光探針100nM，以上混合液低溫凍干，依據上面的分組，分為A顆粒和B顆粒。

7、陽性對照和陰性對照的制備：