[發明專利]一種降低野生型人鼠雜交瘤AL細胞自發突變背景的方法

有效

• 申請號: 201310419228.X
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103529202A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 許安;王希楠;陳少鵬;吳李君;黑國慶
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發明涉及一種哺乳動物細胞突變檢測技術領域，尤其涉及的是一種降低野生型人鼠雜交瘤A_L細胞自發突變背景的方法。

背景技術

基因突變不僅是癌癥發生的關鍵因素之一，而且是環境污染物遺傳毒性評價的重要依據。A_L細胞是中國倉鼠CHO細胞gly^-A突變株與正常人成纖維細胞雜交后所得永生化細胞，含有一整套中國倉鼠CHO-K1染色體和一條人的11號染色體。人的11號染色體可編碼多種細胞表面蛋白，其中包括CD59基因（舊稱為MIC1基因）編碼的CD59細胞表面抗原（舊稱為S1抗原）。由于野生型A_L細胞CD59基因正常表達時在細胞表面形成CD59抗原，在兔血清補體存在的情況下，該抗原與特異性抗體E7.1結合后，導致野生型細胞裂解而無法生存；而突變細胞因不能表達CD59蛋白，無法與抗體和補體作用而得以存活，在培養皿上形成肉眼可見的突變細胞克隆。根據這一特點，A_L細胞已被廣泛用于環境污染物如氡氣、石棉、有機污染物、重金屬等遺傳毒性檢測及相關機理研究。

然而，在連續傳代過程中，野生型A_L細胞的自發突變細胞會不斷增加，導致自發突變背景上升，基因突變檢測的靈敏度下降，為了克服這一現象，在突變實驗前，野生型A_L細胞需采用Panning技術，除去CD59^-的陰性細胞，以達到降低突變本底的目的。該過程具體如下：

（1）山羊抗小鼠IgM處理普通平皿：10ml?IgM/PBS（20μg/ml）IgM溶于PBS中）加入100mm普通平皿中，使其均勻的覆蓋于皿底。室溫，靜止2小時。PBS清洗2次后，加入5ml1%FBS/PBS(1%小牛胎盤血清溶于PBS)，黑暗中保存于4℃（可過夜）；

（2）A_L細胞收集：處于對數生長期的A_L細胞酶解，懸浮于2%FBS/PBS（2%小牛胎盤血清溶于PBS）中。計數，離心，調整細胞密度至2×10⁶/ml。細胞懸浮于含有0.2%CD59抗體的2%FBS/PBS中，冰浴30分鐘。低溫離心，預冷的2%FBS/PBS洗滌3次，并將細胞稀釋至5×10⁵/ml。

（3）細胞與山羊抗小鼠IgM相互作用：棄去平皿中1%FBS/PBS，將5ml懸浮于2%FBS/PBS中的細胞種植移入平皿。4℃孵育2小時。小心吸出上清夜，用預冷的2%FBS/PBS小心洗滌3次，除去沒有貼壁的細胞和CD59^-自發突變細胞。

（4）未突變細胞保存及檢測：加入新鮮的F12完全培養液，連續培養3-4天，收集CD59⁺細胞，凍存于液氮。同時，需要對收集的細胞進行突變背景檢測，這一過程需要14天。如果突變檢測背景仍然偏高，需要重復上述步驟。一般情況下，細胞自發突變背景可降至每10⁵存活細胞中有70-80個突變細胞。由上可見，該方法操作過程繁瑣，一個周期通常需要3周時間，特別是用IgM處理平皿和清洗突變細胞過程對實驗操作人員技術的熟練程度有一定要求。同時，實驗中所使用的特殊抗體—山羊抗小鼠IgM抗體價格較為昂貴，用量大。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種降低野生型人鼠雜交瘤A_L細胞自發突變背景的方法，基于流式細胞分選技術結合特異性熒光抗體，篩選突變及未突變細胞。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟：

（1）野生型細胞收集

收取培養至對數生長期的A_L細胞，酶解消化，懸浮于F12完全培養基中，清洗后制成濃度為±10⁶細胞/100μl的單細胞懸液；

（2）與熒光抗體的結合

加100μl預冷的流式細胞緩沖液重懸細胞后，按配比濃度加入熒光標記的CD59特異性抗體，4℃避光反應30～60分鐘后，用預冷的FACS?Buffer清洗離心，去除未結合的抗體；

（3）制備上樣懸液

重懸細胞于預冷的流式細胞緩沖液后，送入流式細胞分選儀待測；

（4）細胞分選

使用流式細胞分選儀進行分選；

（5）保存

將分選獲得的未突變細胞擴增，液氮保存。

所述細胞包括A_L細胞、由該細胞發展的各種缺陷型細胞以及構建的細胞系。