[發明專利]一種針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法

無效

• 申請號: 201310419151.6
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN103667442A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 蘭道亮;李鍵;熊顯榮;陳亞冰;胡敏;蘇小珊;鐘珍;龔蔚華
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 張澎

技術領域

本發明屬于生物技術和分子生物學領域，具體涉及一種針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法及其應用。

背景技術

轉錄組（Transcriptome）指特定組織或細胞在某一環境或生理條件下所轉錄表達的所有RNA的總和，既包括編碼蛋白的mRNA，也包括了各種非編碼RNA，是連接基因組遺傳信息與蛋白質組生物功能的紐帶。轉錄組研究作為后基因組時代的重要組學研究，其不僅為研究基因表達及調控提供了重要的手段和方法，同時也為發掘功能基因提供了重要路徑，是基因功能及結構研究的基礎和出發點。

大規模轉錄組學檢測技術的發展已有20多年，從最初的差別雜交（differential?hybridization）、mRNA差異顯示（mRNA?differential?display）、抑制消減雜交（suppression?subtractive?hybridization）等技術到當前DNA芯片、基因表達系列分析(Serial?Analysis?of?Gene?Expression)等技術的廣泛應用，轉錄組學研究技術得到了長足進步。而近年來，隨著新一代高通量測序技術的發展，在此基礎上產生的轉錄組測序(RNA-Seq，RNA?sequencing)技術已漸成為大規模研究轉錄組的一種新的且更為有效的方法，并顛覆了傳統轉錄組學的思維方式。

目前，轉錄組高通量測序(RNA-Seq)對樣本的起始RNA量要求較高，一般都至少需要微克級（μg）的RNA，對無法達到最小要求量的樣本是不能進行進一步的轉錄組測序文庫的構建和測序。但是，在許多情況下，如在生殖發育生物學，干細胞，癌癥，考古學，臨床診斷等多種研究中，都無法獲得這樣數量的總RNA。因為上述研究均涉及微量且稀有的樣本，無法滿足目前轉錄組高通量測序的基本RNA量的要求。由于對起始RNA量要求較高，這無形中阻礙了轉錄組高通量測序這項新技術在不同研究領域的進一步應用。

因此，本領域迫切需要在傳統轉錄組高通量測序的基礎上建立一種針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法。

發明內容

本發明目的在于克服現有微量樣本難以滿足轉錄組高通量測序技術的要求的問題，提供一種針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法，旨在解決微量樣本及稀有樣本無法應用轉錄組高通量測序技術的困難。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的。

一種針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法,其特征在于，包括以下步驟：

a.微量樣本總RNA提取;針對真核生物樣本取樣;

b.微量RNA的擴增富集：采用SMART技術對微量RNA進行的相關富集對提取的微量總RNA進行反轉錄及相應的擴增富集;

c.構建cDNA?Illumina-solexa測序文庫:在富集生成的cDNA層面上進行片段化后使用Illumina?HiSeq?^TM2000進行高通量測序。

本發明針對微量樣本的轉錄組高通量測序方法，在實際檢測中，可細化為以下步驟：

a.微量樣本總RNA提取：利用市售的RNeasy?Micro?Kit（Qiagen,Germany）試劑盒對微量樣本的總RNA進行提取。微量樣本其RNA總含量不得低于10pg.

本發明只針對真核生物樣本，不針對原核生物樣本。本發明提取總RNA的試劑盒專門選用了針對微量樣本提取的試劑盒，以保證最大限度的提取效果。經比較市售的相關試劑盒，RNeasy?Micro?Kit（Qiagen,Germany）試劑盒效果較好。

b.微量RNA的擴增富集：利用市售的SMARTer?PCR?cDNA?synthesis?kit?(Clontech,Japan)試劑盒對提取的微量總RNA進行反轉錄及相應的擴增富集。采用了SMART技術對提取的微量RNA進行了相關的擴增富集，以達到進一步測序建庫的要求。實施步驟參照SMARTer?PCR?cDNA?synthesis?kit?(Clontech,Japan)試劑盒說明書并稍加該進，具體如下：