[發(fā)明專利]實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310418647.1 | 申請日： | 2013-09-16 |
| 公開（公告）號： | CN103451304A | 公開（公告）日： | 2013-12-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉金華;史艷宇;劉韜;孟日增;聶丹丹 | 申請（專利權(quán)）人： | 中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64 |
| 代理公司： | 長春市東師專利事務(wù)所 22202 | 代理人： | 張鐵生 |
| 地址： | 130062 吉林*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 實時 熒光 pcr 檢測 貉子 成分 引物 探針 方法 | ||
1.實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針，分別為：
上游引物Pl：CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC；
下游引物P2：GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA；
帶有熒光染料的探針序列為:?CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的引物探針，其特征在于：所述的熒光染料，5′端為FAM標記，3′eclipse標記。
3.實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其步驟如下：
a.提取待檢樣品基因組DNA；
b.以所提取的DNA作為模板,加入權(quán)利要求1所述的引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應(yīng)液進行實時熒光PCR反應(yīng)，記錄樣品反應(yīng)的Ct值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的實時熒光PCR反應(yīng)體系為：
2×Real-time?PCR預(yù)混液?10μL，
上游引物（10?μmol/L）?1μL，
下游引物(10?μmol/L）???1μL，
探針(10?μmol/L）????????1μL，
樣品DNA(1～100?ng/μL)??2μL，
ddH2O??????????????????5μL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的實時熒光PCR反應(yīng)條件為95℃10min,1個循環(huán)；95℃，15s，60℃30s,40個循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3?、4或5所述的實時熒光PCR檢測貉子源性成分的方法，其特征在于：所述的實時熒光PCR方法還設(shè)有空白對照、陰性對照、陽性對照，判定標準為:
空白對照:以ddH2O為模板,按照b和c所述條件,進行實時熒光PCR反應(yīng),檢測Ct值大于或等于40;
陰性對照:以非貉子源性物種基因組DNA為模板,按照b和c所述條件,進行實時熒光PCR反應(yīng),檢測Ct值大于或等于40;
陽性對照:以貉子基因組DNA為模板,按照b和c所述條件,進行實時熒光PCR反應(yīng),檢測Ct值小于或等于34;
待測樣品貉子源性基因檢測Ct值大于或等于40，陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常者,判定該樣品未檢出貉子源性基因;待測樣品貉子源性基因檢測Ct值小于或等于36，陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常者,判定該樣品檢出貉子源性基因;待測樣品貉子源性基因檢測Ct值在36-40之間，重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后結(jié)果Ct值大于400且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常,判定該樣品未檢出貉子源性基因;再次擴增后結(jié)果Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常,判定該樣品檢出貉子源性基因。
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