[發明專利]一種化妝品檢測

無效

• 申請號: 201310417393.1
• 申請日: 2013-09-13
• 公開（公告）號: CN104459145A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王阿慧
• 申請（專利權）人: 王阿慧
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及能源化工領域，特別涉及一種化妝品檢測。

背景技術

化妝品已經成為現代人必不可少的日常用品，而化妝品對皮膚的刺激性是檢測化妝品是否合格的重要標準。現在最常用的1944年John?Draize建立的皮膚刺激性和腐蝕性實驗，但是該實驗存在一定的缺陷：兔的皮膚和人的皮膚在生理性能，對周圍環境和化學物質的反應上不同，盡管從兔的皮膚實驗獲得的數據被作為刺激性評價的參考標準，但是由于很少的兔和人皮膚刺激實驗結果被用來做對比研究，所以有些化學物質在兔和人的皮膚實驗差距仍然比較大。兔皮膚刺激實驗的重復性比較差。而且不再以動物模式為基礎的毒理學系統已成為生物醫學的重要發展方向，并被政府和國際法規所接受。一些動物實驗替代方法已發展成為關系國際貿易的技術壁壘。

在專利CN?101297981?A中公開一種組織工程皮膚構建方法，其特征在于，包括以下步驟：?(1)配制組織工程皮膚培養液：以商用無血清表皮細胞培養液為基礎液，再按每500mL基?礎液標準添加胰島素20～50ng，氫化可的松100～300μg，維生素C20～40mg，氯化鈣1～2mM；?(2)制備人體成纖維細胞飼養層：將人體來源的成纖維細胞經抑制增殖處理后，以常規細胞?培養液添加體積比2～20％血清培養；?(3)制備凝膠生物材料：將I型膠原蛋白、殼聚糖、透明質酸和硫酸軟骨素按照8～12∶1～3∶1～2∶1～2質量份配比混合均勻，然后以1M氫氧化鈉溶液調節PH至7.2～7.4；?(4)構建和培養組織工程皮膚：將所述步驟(2)制備的1～10×105個成纖維細胞與1～3mL?所述步驟(3)制備的凝膠生物材料充分混合，得復合物，所述復合物在37℃，5％CO2培養?箱中培養2h，然后在上面添加1～10×105/mL人源表皮細胞懸液1mL，繼續培養1h后，添加?由所述步驟(1)配制的組織工程皮膚培養液3～5mL，繼續培養至第5天，將所得的組織工?程皮膚進行氣液面培養，第20天結束培養，獲得含有完好分化和成熟的表皮結構的組織工程皮膚。但是該發明的缺點在于應用膠原或脫細胞基質作為支架，這類支架內部有如海綿狀的空隙或表面凹凸不平，在評價化學物質的刺激性時，容易附著化學物質不容易去除，膠原材料在接種細胞后容易收縮，所構建的組織工程表皮面積不容易保持在一定的規格，這些限制導致了應用此類組織工程表皮作檢測使用時存在較大不可避免的誤差。

發明內容

本發明應用組織工程方法，以聚碳酸脂膜為支架，以人皮膚角質形成細胞為細胞來源，構建組織工程表皮模型，經檢測HE染色、免疫熒光染色及透射電鏡觀察顯示，構建的組織工程表皮模型分化良好，具有與正常表皮相似的結構：基底膜、棘層、顆粒層和角化層。組織工程表皮模型的IC50值為0.183%（6.00?mmol/L）。在聚碳酸酯膜上構建的組織工程表皮模型具有與正常表皮相似的組織結構，并且具有一定的屏障功能。

本組織工程皮膚模型是在在聚碳酸酯膜上構建的表皮模型，優點有：聚碳酸酯膜有很好的生物相容性；采用面積一定的商品化的聚碳酸酯膜濾膜作為支架，該支架材料表面光滑，面積可以根據檢測需要定制的特點，在其上構建的組織工程皮膚模型更容易商品化。本發明所構建的模型具有和正常皮膚相似的表皮分化結構，具有模擬化妝品作用于人表皮的功能，通過分析化妝品刺激作用后的組織工程表皮，可以比較準確判斷化妝品的刺激性。

具體實施方式：

1、主要試劑及儀器

Epilife?培養基、0.125%胰蛋白酶、DispaseⅡ型分離酶、SDS?、牛血清白蛋白、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、MTT、角蛋白10（keratin?10，K10）和?K13（K10?&?K13）抗體、K14?抗體、層粘連蛋白（Laminin）抗體、FITC標記山羊抗兔IgG?、FITC標記山羊抗鼠IgG?、角化細胞交聯外膜蛋白（Involucrin）抗體、中間絲相關蛋白（Filaggrin）抗體、Millicell細胞培養板。

CO₂?培養箱、低溫冰箱、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡、低溫離心機。

2、脂質混合物配制?

將0.1?mol/L?NaOH?加熱至70℃溶解軟脂酸、亞油酸和花生四烯酸，將所得到的脂肪酸混合溶液與10%牛血清白蛋白混合，55℃恒溫搖床10?min，使終濃度為軟脂酸250μmol/L、亞油酸150μmol/L、花生四烯酸70μmol/L和牛血清白蛋白240μmol/L?。

3、組織工程表皮模型構建

取健康的人體包皮，進行角質形成細胞分離培養。Millicell細胞培養板的聚碳酸脂膜（孔徑?0.4μm?，面積0.63cm²）經Ⅳ型膠原處理后，按細胞密度5×10⁵個/cm²接種第1代角質形成細胞，置于37℃、5%CO₂?培養箱以Epilife?培養基培養，24?h?后換液，48?h?后改為氣液面培養13?d。氣液面培養時于Epilife?培養基中添加脂質混合物，每100?毫升培養基中添加10?mL?脂質混合物，并添加CaCl₂?，使Ca²⁺濃度達1.5?mmol/L，添加抗壞血酸使濃度達50μg/mL，培養13d后見表皮表面干燥、無培養基從膜底部滲透至表面，提示組織工程表皮模型制備成功。