[發(fā)明專利]一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310416012.8
• 申請(qǐng)日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN103432579A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柴同杰;劉雪慧;王海榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/08
• 分類號(hào): A61K39/08;A61K9/107;A61P31/04
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• 代理人: 暫無信息

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。

（二）發(fā)明背景

B型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起羔羊痢疾、綿羊、山羊、駒及犢牛的腸毒血癥或壞死性腸炎，主要致病毒素為α、β、ε毒素。由β-毒素引起的壞死性腸炎，一般認(rèn)為是由于食物中的胰蛋白酶阻止了腸道中該毒素的分解，從而導(dǎo)致該病的發(fā)生。此外，該毒素可能還是一種神經(jīng)毒素。而B型ε-毒素的分泌量少，它則可促使動(dòng)物的主動(dòng)脈和其它動(dòng)脈收縮而導(dǎo)致血壓升高；此外，還具有與血腦屏障內(nèi)血管上皮受體結(jié)合的能力，從而引起血管通透性增高，最終導(dǎo)致致死性水腫，但ε-毒素不耐熱（Mcdonel,1986）。

多年來，我國(guó)生產(chǎn)中使用的是滅活菌苗，早在1989年，陳錫全等已經(jīng)開展了“兔病毒性出血癥和A型魏氏梭菌聯(lián)苗”的研究并且取得成功；佟承剛等（1991）研制兔的魏氏梭菌單苗，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以產(chǎn)生82.01%的保護(hù)率；魯承（1997）等對(duì)兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二聯(lián)苗進(jìn)行了研究；楊瑛（1997）對(duì)A型魏氏梭菌氫氧化鋁滅活苗進(jìn)行研究，疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保護(hù)小鼠、兔和豬抵抗標(biāo)準(zhǔn)A型1MLD毒素的攻擊；姚湘燕等（1998）采用三個(gè)不同來源的牛源魏氏梭菌分離株研制牛魏氏梭菌濃縮AL(OH)₃滅活苗；王克領(lǐng)（1998）等對(duì)兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏桿菌病三聯(lián)苗進(jìn)行了研究；譚詩文等（2000）進(jìn)行了羔羊痢疾、羊腸毒血癥、大腸桿菌病、羊猝狙四聯(lián)油佐劑滅活苗的研制。這些菌苗對(duì)該病的預(yù)防有一定的效果，同時(shí)也存在一些不足：最關(guān)鍵地是疫苗中的有效成分主要為菌體抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體只能夠中和菌體抗原，卻難以中和毒素抗原，與家畜“猝死癥”致病機(jī)理不全相符。因此，滅活菌苗的有效性還存在一些質(zhì)疑。

柴同杰（2001）對(duì)家畜“猝死癥”致病機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)：在某種應(yīng)激狀態(tài)下，動(dòng)物腸道中微生態(tài)平衡破壞，使魏氏梭菌呈‘爆炸性’的繁殖，瞬間產(chǎn)生大量的外毒素，腸粘膜通透性的升高使得毒素或細(xì)菌+毒素進(jìn)入血液循環(huán)引起毒血癥（有時(shí)伴有菌血癥），從而導(dǎo)致重要器官的衰竭，造成動(dòng)物死亡；由此，進(jìn)一步提出，“魏氏梭菌感染致病以及動(dòng)物快速死亡的主要原因是腸源性毒血癥，預(yù)防的關(guān)鍵在于針對(duì)毒素引起的毒血癥，疫苗的抗原成分應(yīng)是相應(yīng)的類毒素”的學(xué)說。

B型產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā)的羔羊痢疾等疾病發(fā)病急，死亡快，有時(shí)癥狀不太明顯并且根本來不及治療。要從根本上控制本病的傳播，減少或避免經(jīng)濟(jì)損失，必須采取切實(shí)有效的預(yù)防措施。產(chǎn)氣莢膜梭菌形成的主要外毒素的化學(xué)成分為蛋白質(zhì)，具有較好的免疫原性。因此，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病機(jī)理，制備產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素，將其滅活后做成類毒素疫苗，用于畜禽預(yù)防。

（三）發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明發(fā)明提供了一種效價(jià)全、免疫力強(qiáng)、針對(duì)性好、無毒副作用的羔羊痢疾B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，用于動(dòng)物的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌病特別是羔羊痢疾的預(yù)防，控制羔羊痢疾等B型產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行。

羔羊痢疾等B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1B型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上在厭氧環(huán)境（氣體的組成為85％氮?dú)?％氫氣6％二氧化碳）下37℃46h復(fù)蘇。

2B型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境（氣體的組成為85％氮?dú)?％氫氣6％二氧化碳）下38℃14h培養(yǎng)增菌。

3將8ml上述培養(yǎng)物加入到產(chǎn)毒培養(yǎng)基（每100mlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸）中，在厭氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，221擺/min，38℃培養(yǎng)5h，然后在4℃3800g離心15min，再用孔徑0.22μm的蔡氏濾器中過濾除菌,即得外毒素溶液。

4在外毒素溶液中加入外毒素溶液體積比為0.3%的甲醛，充分振蕩混勻，置37℃48h滅活，間隔5-6h振搖一次，得到滅活好的類毒素溶液。

5在類毒素溶液中按1:1體積比加入滅菌的白油佐劑乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗；

所述白油佐劑構(gòu)成：9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液體積比2%的Tween-20和質(zhì)量比1%的硬脂酸鋁；

所述的血平板培養(yǎng)基成分為：100毫升蒸餾水、3.7g豆粉瓊脂、1g葡萄糖和5%體積比綿羊血；

所述的產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為：每100mlPBS緩沖液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸；