[發(fā)明專利]一種抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310415689.X
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN103468681A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 瞿介明;張靜;吳棟;陸運(yùn)濤
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N5/071;A61K48/00;A61P11/00
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種siRNA，尤其涉及一種抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

慢性阻塞性肺疾?。–hronic?Obstructive?Pulmonary?Disease,COPD）是一種常見、多發(fā)、高致殘性和高致死性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。COPD患者典型的肺實(shí)質(zhì)破壞表現(xiàn)為小葉中央型肺氣腫，其導(dǎo)致的氣流阻塞是器質(zhì)性和永久性的改變，現(xiàn)有治療方法并不能有效預(yù)防及逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的肺組織破壞和肺功能損害。作為維持組織彈性和呼吸周期中肺泡正常開放和回縮的主要成分，彈性蛋白破壞是肺氣腫的主要原因。CN102499925A公開了一種中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，其活性成分為具有五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)的化合物，通過抑制彈性蛋白酶來減少彈性蛋白的降解，從而緩解肺氣腫等疾病。CN1201730A公開了用RAR選擇性視黃醛衍生物激動(dòng)劑治療肺氣腫，通過促進(jìn)彈性蛋白原基因表達(dá)，來達(dá)到治療肺氣腫的目的。但是目前還沒有有效促進(jìn)肺組織彈性蛋白生成并有序沉積的有效方法。

多功能蛋白聚糖1（Versican1，V1）是一種富含硫酸軟骨素（chondroitin?sulfate,CS）的蛋白多糖，可通過形成局部高CS濃度而促進(jìn)彈性蛋白原脫落來抑制彈性蛋白生成。在皮膚以及動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)V1高表達(dá)可抑制彈性蛋白形成。但是肺組織結(jié)構(gòu)特殊，不同于皮膚及動(dòng)脈；而且COPD是一個(gè)慢性疾病，吸煙及空氣污染是其重要的危險(xiǎn)因素，目前缺乏特異性抑制V1達(dá)到修復(fù)煙草所致的彈性蛋白受損的方法。

近年來，利用RNA干擾技術(shù)，將化學(xué)合成的小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)至特定的細(xì)胞，沉默相關(guān)基因的表達(dá)，是研究基因功能最有效的手段之一，使用RNAi治療疾病的思路是根據(jù)病原體的致病基因序列以及生物體內(nèi)與疾病發(fā)生相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列具有同源性的小干擾RNA（siRNA），然后通過某種方式將siRNA轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)使有關(guān)疾病基因發(fā)生沉默，從而達(dá)到治療的目的。其優(yōu)勢在于只抑制疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)，而不損傷正常細(xì)胞功能，其序列特異性及基因抑制作用的強(qiáng)大性是其他藥物難以匹敵的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種特異性抑制V1表達(dá)的siRNA，本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種抑制多功能蛋白聚糖1（Versican1，V1）表達(dá)的siRNA，所述siRNA序列如下：

正義鏈：5′-GAGGCUGGAACUGUUAUUATT-3′，

反義鏈：5′-UAAUAACAGUUCCAGCCUCTT-3′。

本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種低表達(dá)多功能蛋白聚糖1的肺成纖維細(xì)胞，所述肺成纖維細(xì)胞攜帶有權(quán)利要求1所述的siRNA。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種構(gòu)建上述低表達(dá)多功能蛋白聚糖1的肺成纖維細(xì)胞的方法，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將權(quán)利要求1所述的siRNA轉(zhuǎn)染至肺成纖維細(xì)胞中，即得。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法中使用的脂質(zhì)體為脂質(zhì)體TM2000。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肺成纖維細(xì)胞為經(jīng)受煙草刺激的肺成纖維細(xì)胞。

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供上述抑制V1的siRNA在在制備促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白修復(fù)的藥物或材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供上述抑制V1表達(dá)的siRNA在制備治療肺氣腫藥物或材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的抑制多功能蛋白聚糖1表達(dá)的siRNA，能夠特異性抑制和下調(diào)多功能蛋白聚糖1的表達(dá)，有效促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白的沉積，并且具有長期作用的特點(diǎn)，符合COPD的疾病特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的siRNA轉(zhuǎn)染肺成纖維細(xì)胞后V1表達(dá)結(jié)果圖，圖A為V1mRNA相對表達(dá)水平圖，圖B為V1和彈性蛋白檢測結(jié)果圖；

圖2為檢測本發(fā)明提供的siRNA對煙草所致的肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白喪失的影響的流程圖，圖A為彈性蛋白mRNA檢測結(jié)果圖，圖B為上清液中可溶性彈性蛋白含量檢測結(jié)果圖，圖C為彈性蛋白沉積量檢測結(jié)果圖，^*p<0.01，#p<0.001；

圖3為煙草對CCL-210人肺成纖維細(xì)胞系合成彈性蛋白原以及彈性蛋白沉積的影響結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明提供的siRNA對煙草所致的CCL-210人肺成纖維細(xì)胞彈性蛋白沉積的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式