[發(fā)明專利]一種含人Rad51C啟動(dòng)子的載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310415502.6
• 申請(qǐng)日: 2013-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN103952440A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許艷;曹艷;毛志勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 同濟(jì)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種載體及其應(yīng)用，尤其是涉及一種含人Rad51C啟動(dòng)子的載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤治療的目的在于能夠選擇性地殺傷或者清除惡性增殖細(xì)胞而不對(duì)正常細(xì)胞造成傷害。在2000年，有文獻(xiàn)報(bào)道根據(jù)端粒酶hTER和hTERT在腫瘤細(xì)胞中具有活性而在正常細(xì)胞中沒有活性的特點(diǎn)，利用hTER和hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列來調(diào)控外源毒性基因在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。隨后Christopher等人利用重組酶蛋白R(shí)ad51在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)的特點(diǎn)，也成功實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)體外，轉(zhuǎn)錄水平上靶向抗腫瘤的治療。

重組酶Rad51是大腸桿菌RecA的同源蛋白質(zhì)，它通過介導(dǎo)DNA鏈配對(duì)以及鏈交換而參與DNA的同源重組修復(fù)。在人類中Rad51有5種家族成員XRCC2、XRCC3、Rad51B／Rad51L1、Rad51C／Rad51L2、Rad51D／Rad51L3，它們對(duì)于形成DNA損傷誘導(dǎo)的Rad51foci的組裝是必須的。它們形成兩個(gè)復(fù)合體，輔助Rad51進(jìn)行DNA雙鏈斷裂中的同源重組修復(fù)，并且依賴于BRCA-1和BRCA-2途徑輔助。這一同源同組修復(fù)過程還需要其他的蛋白R(shí)ad52，Rad54，Rad55，Rad57，RPA的幫助。因此這些蛋白質(zhì)也有可能具有與Rad51相同的表達(dá)特異性，也存在潛在的靶向抗腫瘤的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種含人Rad51C啟動(dòng)子的載體及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種含人Rad51C啟動(dòng)子的載體，包括Rad51C啟動(dòng)子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列，所述的Rad51C啟動(dòng)子序列如SEQ?ID?No：1所示，與序列相同或者具有90％相似性的序列均為該專利的保護(hù)范圍。

所述的編碼具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白的核酸序列的轉(zhuǎn)錄過程由Rad51C啟動(dòng)子調(diào)控。

所述的Rad51C啟動(dòng)子序列為人類的Rad51C蛋白的啟動(dòng)子序列。

所述的具有腫瘤治療作用的效應(yīng)蛋白為有毒蛋白。

所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A鏈(DTA)、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。白喉毒素蛋白A鏈(DTA)是ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶，能夠抑制真核生物蛋白合成，具有高毒性和廣毒性，可以通過組織特異性表達(dá)殺傷腫瘤細(xì)胞；蓖麻毒蛋白(ricin)是蓖麻種子中的一種毒蛋白，它由分子量分別為32KD和34KD的A、B兩條鏈組成，分別為效應(yīng)鏈和連接鏈，是真核細(xì)胞核糖體失活蛋白，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性；凋亡蛋白家族的成員caspase3、caspase6、caspase7、caspase8是能夠引起細(xì)胞程序性死亡的蛋白酶。也可以應(yīng)用于特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。

作為優(yōu)選，所述的有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈。當(dāng)有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈時(shí)，該載體的序列如SEQ?ID?No：2所示。

一種含人Rad51C啟動(dòng)子的載體在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

通過腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)的Rad51C的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)有毒蛋白DTA在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)而針對(duì)性地殺傷腫瘤細(xì)胞。DTA的開放式閱讀框序列如SEQ?IDNo：3所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種含人Rad51C啟動(dòng)子的核酸序列，并提供了該核酸序列在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。將Rad51C啟動(dòng)子和編碼DTA的開放閱讀框整合構(gòu)成的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，能夠明顯殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞基本無影響。

附圖說明

圖1-1為Rad51、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在14株細(xì)胞中的表達(dá)水平分析結(jié)果；

圖1-2為Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析結(jié)果；

圖2-1為Western?blot結(jié)果圖；

圖2-2為Rad51C蛋白質(zhì)和Actin蛋白質(zhì)的表達(dá)條帶進(jìn)行量化，并用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析結(jié)果；

圖2-3為Rad51C在正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平Mann-whitney檢驗(yàn)分析結(jié)果；

圖3-1為pRad51C-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；

圖3-2為pRad51C-Luc質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；

圖3-3為pRad51C-DTA質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；