[發明專利]表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像方法及裝置

有效

• 申請號: 201310415225.9
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103472576A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 祝連慶;周哲海;郭陽寬;婁小平;張蔭民;孟曉辰
• 申請（專利權）人: 北京信息科技大學
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B26/08
• 代理公司: 北京律恒立業知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11416
• 代理人: 蔡艷園;顧珊

技術領域

本發明涉及表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像技術，具體涉及一種基于高級次軸對稱偏振光束的表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像方法及裝置。

背景技術

全內反射熒光顯微成像(Total?Internal?Reflection?Fluorescence?Microscopy,TIRFM)通過使入射光束超過臨界角入射以在玻璃-樣品界面產生倏逝場，從而有選擇地激發界面附近的熒光分子，實現細胞微細結構的顯微成像。全內反射熒光顯微成像技術不僅可以幫助進一步理解細胞功能，同時改進了探測信號的信噪比。但是，當對生物微結構進行動態快速成像時，幀采集速率較大，通常大于100幀/秒，需要進一步增加熒光信號強度。為此，提出了基于表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像技術(Surface?Plasmon?Enhanced?TIRFM,SPE-TIRFM)，該技術利用表面等離子體增強效應提高了熒光激發效率，同時進一步抑制了背景噪聲。最近幾年，關于SPE-TIRFM的研究取得了很大的進展，受到了業界的廣泛關注，包括Nikon在內的多家公司也開發了相應產品。總體來說，基于表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像技術作為全內反射熒光顯微成像技術的一個典型方案，具有很重要的研究價值，對于進一步提高單分子熒光成像的空間分辨率和成像速度也具有重要的應用價值。

發明內容

本發明將一種獨特的空間偏振變化的矢量光束—高級次軸對稱偏振光束，引入到基于表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像技術系統中，通過合理的系統設計，以進一步提高系統的成像性能。

根據本發明的一個方面，提供了一種基于高級次軸對稱偏振光束的表面等離子體增強全內反射熒光顯微成像方法，包括如下步驟：激光器發出的激光束經過針孔濾波器進行空間濾波，然后被準直透鏡準直為平行光束；該平行光束入射到偏振轉換系統中進行偏振態轉換，獲得高級次軸對稱偏振光束；獲得的高級次軸對稱偏振光束進一步通過光瞳濾波器和環形光闌進行振幅及相位調制，其中環形光闌的作用是阻擋光束中間區域部分入射到聚焦物鏡中，從而消除由于中間區域光束透射進行熒光激發導致的背景噪聲；經過調制后的高級次軸對稱偏振光束經過二向色分束鏡反射到高數值孔徑的聚焦物鏡中進行聚焦，并射入“玻璃基底-金屬薄膜-樣品”的三層結構上；根據表面等離子體波激發需要滿足的相位匹配條件，只有滿足某一諧振角度范圍的光束才能透射過三層結構，在金屬表面激發較強的表面等離子體波光場；在金屬表面激發的表面等離子體波沿著表面以行波的形式傳播，彼此干涉形成一干涉場，但是該波的強度沿著垂直金屬表面的軸向以指數形式衰減，因此，該表面等離子體波場只能激發金屬界面附近的熒光分子；激發的熒光信號通過“樣品-金屬薄膜-玻璃基底”三層結構反射回聚焦物鏡中，并被其擴束，通過二向色分束鏡透射，經過濾波片濾波后，最終被一聚光鏡聚焦到針孔陣列板上，在針孔后面放置探測器，將光信號轉換為電信號，并進一步送入計算機進行后續的分析處理。

優選地，所述方法還包括采用光束偏轉系統，以調控聚焦光束的聚焦位置，從而控制在金屬-樣品表面激發的表面等離子體波場的區域，進而控制熒光分子的激發區域。

優選地，所述光束偏振系統采用基于棱鏡的光束偏轉功能，將入射的平行光束轉換為不同偏轉角度的平行光束，然后采用一對透鏡組成的望遠鏡結構，將入射的平行光束轉換為偏轉方向和光斑大小可控的平行光束，使滿足偏轉方向和光斑大小的光束入射進聚焦物鏡，其中光束偏轉角度以及光斑大小與兩透鏡的焦距比值有關。

優選地，光束偏轉系統使用一電控偏轉器進行光束偏轉。

優選地，所述高級次軸對稱偏振光束的偏振級次小于5。