[發(fā)明專利]一種酸性磷酸酶突變體、編碼基因、載體及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310414756.6
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN103555687A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭裕國;孫麗慧;沈愛萍;沈寅初
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12P19/32
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酸性磷酸酶突變體及其編碼基因，以及含有該基因的載體和應(yīng)用。

（二）背景技術(shù)

呈味核苷酸I+G作為新一代食品增鮮劑，由5’-肌苷酸（5’-IMP）和5’-鳥苷酸（5’-GMP）按1:1混合而成。I+G具有比谷氨酸鈉（味精）更鮮美的呈味效應(yīng)，也可與味精混合使用，具有相乘的協(xié)同效應(yīng)，并且能夠顯著降低產(chǎn)品成本，廣泛應(yīng)用與食品加工領(lǐng)域。

I+G的呈味作用取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)只有核苷5’-位碳原子上的羥基與磷酸基團發(fā)生酯化才表現(xiàn)出鮮味活性，而2’-和3’-位碳原子的羥基磷酸酯化無活性。因此，通過磷酸化反應(yīng)將肌苷或鳥苷轉(zhuǎn)化為呈味核苷酸，關(guān)鍵是如何使核苷的5’-位磷酸酯化反應(yīng)。相比化學(xué)磷酸化方法而言，利用酸性磷酸酶生物催化無機焦磷酸（PPi）的磷酸根特異地轉(zhuǎn)移到核苷分子的特定位置上，該反應(yīng)不需要ATP，具有反應(yīng)條件溫和、位置特異性強、轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境友好等特點，具有獨特的優(yōu)勢和潛力。酸性磷酸酶催化肌苷和鳥苷磷酸化生成5’-IMP和5’-GMP的過程如下式所示：

20世紀70年代末，加拿大著名科學(xué)家Smith首次發(fā)明了寡聚核苷酸定點突變技術(shù)，研究表明，多點突變的效果往往比單點突變更為理想。點飽和突變技術(shù)在提高催化活性，減少副反應(yīng)，提高熱穩(wěn)定性，改變底物結(jié)合特異性等方面有顯著的作用。此外點飽和突變技術(shù)在醫(yī)藥，農(nóng)牧業(yè)和環(huán)境保護，蛋白質(zhì)基因表達與調(diào)控等研究領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣闊。點飽和突變技術(shù)的原理是在靶位點處設(shè)計兼并引物并對目的基因進行擴增以獲得靶位點處氨基酸分別被其它19種天然氨基酸所替代的突變子。一般將兼并引物設(shè)計成NNN或NNX（N代表4種核苷酸等比例混合物；X代表2種核苷酸等比例混合物（如G/C或G/T）。

Asano等最早開展了酶法磷酸化生產(chǎn)5’-IMP和5’-GMP的研究，首次研究發(fā)現(xiàn)了Morganella?morganii的磷酸酶具有選擇性磷酸化酶活性，對肌苷和鳥苷的催化效率大致相同，為簡單的一步轉(zhuǎn)移磷酸基團反應(yīng)。然后他們從M.morganii中分離純化得到選擇性磷酸化酶，并成功克隆到控制其磷酸轉(zhuǎn)移活性的基因，在此基礎(chǔ)上利用易錯PCR的技術(shù)通過隨機突變建立突變文庫，成功得到具有兩個突變點（G74D/I153T）的磷酸轉(zhuǎn)移活性的基因，將其導(dǎo)入Escherichia?coli，得到一株含有G74D/I153T的突變體的高產(chǎn)酸性磷酸酶突變株。由于該酶在轉(zhuǎn)移磷酸基團的同時也在催化磷酸水解，因此要盡可能的抑制其水解活性，針對這一問題，他們找到與M.morganii有著高度同源性的Escherichia?blattae，并以E.blattae為出發(fā)菌株，采用定點突變，對酸性磷酸酶基因引入突變（S72F/G74D/I153T），成功提高了該酶的磷酸轉(zhuǎn)移活性，同時也降低了其水解酶的活性。Mihara等利用點飽和突變技術(shù)對E.blattae酸性磷酸酶EB-AP/PTase的一些活性位點進行突變，獲得了一個包含11個氨基酸突變的良性突變體（L63Q，A65Q，E66A，N69D，S71A，S72A，G74D，D116E，T135K，E136D，I153T），該突變酶活性明顯提高。

然而，目前酸性磷酸酶EB-AP/PTase存在的主要問題是酶活力相對較低，導(dǎo)致酶法生產(chǎn)I+G成本較高。因此提高酸性磷酸酶酶活力，對推動呈味核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種酶活提高的酸性磷酸酶突變體，為綠色生產(chǎn)呈味核苷酸I+G提供條件。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種酸性磷酸酶突變體，由SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列經(jīng)點突變得到，所述點突變?yōu)椋旱?08位突變?yōu)榻z氨酸，和/或第143位突變?yōu)榱涟彼帷Ｋ鐾蛔凅w是以SEQ?ID?No:1為出發(fā)序列，經(jīng)過多輪點飽和突變，篩選獲得的酶活力提高的酸性磷酸酶突變體。

具體的，所述酸性磷酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2（AP/PT-D108S）或SEQ?ID?No.3所示（AP/PT-D108S/N143L）。

本發(fā)明還涉及編碼所述酸性磷酸酶突變體的基因。

具體的，所述基因序列如SEQ?ID?No.5或SEQ?ID?No.6所示。

本發(fā)明還涉及含有所述基因的重組載體，以及所述的基因在制備重組酸性磷酸酶突變體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的酸性磷酸酶突變體在生產(chǎn)呈味核苷酸中的應(yīng)用。