[發明專利]DNA結合蛋白的檢測方法

有效

• 申請號: 201310413728.2
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103472236A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 張春陽;張艷
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/52
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

1.一種DNA結合蛋白的檢測方法，包括如下步驟：

提供待檢測的DNA結合蛋白的樣品溶液，在Exo?III存在的條件下進行消化反應，反應完全后得到消化液，其中，未被Exo?III切割的DNA的反義鏈作為引物被保留在所述消化液中；

將所述消化液加入到擴增體系中，在聚合酶、內切酶和擴增模板存在的情況下，進行等溫擴增反應，反應完全后得到擴增液，其中，所述擴增模板包括n段重復序列以及n-1段依次連接所述重復序列的連接序列，所述引物與所述重復序列特異性結合，所述連接序列包括所述內切酶的酶切位點，n為不小于2的整數，所述引物擴增后得到所述擴增模版的互補序列，所述擴增模版的互補序列被所述內切酶切割形成n段包含所述重復序列的靶DNA；

提供納米金顆粒溶液，并將所述納米金顆粒溶液與含有第一檢測探針和第二檢測探針的溶液混合后進行孵育，孵育完成后得到納米金檢測探針溶液，其中，所述第一檢測探針與所述靶DNA特異性互補，所述第二檢測探針與所述靶DNA特異性互補；

將所述擴增液和所述納米金檢測探針溶液混合，反應完全后對混合液進行檢測，完成所述DNA結合蛋白的檢測。

2.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述提供待檢測的DNA結合蛋白的樣品溶液的操作為：

將HeLa細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養，置于加濕處理的含有5%二氧化碳的37℃培養箱中，加入20納克每毫升TNF-α進行刺激，30分鐘后用細胞核提取物試劑盒裂解細胞，收集細胞提取物即為所述待檢測的DNA結合蛋白的樣品溶液。

3.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述DNA結合蛋白為NF-κB?p50蛋白。

4.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述聚合酶為KF聚合酶，所述內切酶為Nb.BbvCI內切酶。

5.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，n=2。

6.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述納米金顆粒溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸法制備得到。

7.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，對所述混合液進行檢測的操作可以為：肉眼直接觀察，混合液中的納米金檢測探針發生聚集，顏色由紅色變為紫色。

8.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，對所述混合液進行檢測的操作可以為：采用分光光度計檢測混合液，光譜采集范圍為410nm～800nm，檢測最大吸收峰。

9.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述作為引物的DNA的反義鏈的序列為SEQ?ID?No.1所示的序列。

10.根據權利要求1所述的DNA結合蛋白的檢測方法，其特征在于，所述擴增模板的序列為SEQ?ID?No.2所示的序列；

所述第一檢測探針的序列為SEQ?ID?No.3所示的序列；

所述第二檢測探針的序列為SEQ?ID?No.4所示的序列。