[發明專利]一種枯草芽孢桿菌基因文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201310413350.6
• 申請日: 2013-09-12
• 公開（公告）號: CN104233475A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 趙曉宇;孟立強;曹旭;張淑梅;李晶;王佳龍;陳靜宇;姜威
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/31;C12N15/63
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

1.一種枯草芽孢桿菌基因文庫的構建方法，其特征在于枯草芽孢桿菌基因文庫按以下步驟構建：

一、將活化好的枯草芽孢桿菌B29接種至LB固體培養基，30℃過夜培養，然后挑取單菌落轉接于LB液體培養基中，再30℃、150r/min條件下培養6～8小時，再提取枯草芽孢桿菌B29基因組DNA；

二、培養含有pUC19質粒DNA的大腸桿菌，然后提取pUC19質粒；

三、基因組不完全酶切及不完全酶切產物回收

將Sau3A原酶液以100倍稀釋后加入不完全酶切反應體系，然后37℃水浴10min、再65℃、20min滅活Sau3A活性，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；并回收3～5kb的DNA片段，保存備用；

四、載體去磷酸化

用BamHI酶酶切pUC19質粒DNA，然后向回收的pUC19質粒DNA大片段中加入10倍體積的去磷酸化緩沖液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基團加入1個單位的牛小腸堿性磷酸酶，37℃反應30分鐘；然后再加入十二烷基磺酸鈉至終濃度0.5%、加入pH值為8.0的EDTA至終濃度5mmol/L、加入蛋白酶K至終濃度50μg/ml，混勻后56℃反應30分鐘，再10分鐘滅活牛小腸堿性磷酸酶，冷卻至室溫后加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次；加入冰乙醇沉淀，離心，抽干，溶于無菌去離子水，-20℃保存備用；

五、連接和轉化

將步驟四pUC19去磷酸化質粒大片段和步驟三回收的不完全酶切產物放入混合連接體系，然后16℃連接過夜，再放入50μl冰浴上融化的感受態細胞E.coli?DH5α中，輕輕混勻后冰浴中放置30min；之后42℃水浴中熱激45s，再立即轉移到冰浴中2min，而后加入500μl不含抗生素的LB培養基，混勻后置于37℃、200r/min條件下培養1h；然后將已轉化的感受態細胞E.coli?DH5α加到含氨芐抗性的LB瓊脂培養基上，倒置平板、置于37℃環境中培養8～12h；

六、文庫擴增和保存

將步驟五培養出的菌落用滅菌牙簽接種于含20mg/mL氨芐的LB液體中，在37℃、200r/min條件下振蕩培養過夜，然后加入等體積已滅菌、濃度為40%的甘油，混勻，置于-80℃冰箱中保存，即完成枯草芽孢桿菌基因文庫的構建；

步驟三中不完全酶切反應體系為20μl，由3.3μl枯草芽孢桿菌B29基因組DNA、14μl?H₂O、0.5μl稀釋Sau3A酶液、0.2μl牛血清白蛋白和2μl緩沖液組成；

步驟四中去磷酸化緩沖液pH值為8.0，去磷酸化緩沖液中ZnCl₂濃度為10mmol/L、MgCl₂濃度為10mmol/L、Tris·HCl濃度為100mmol/L；

步驟五中混合連接體系總體積為10μl，由10×連接酶buffer1μl、不完全酶切產物1μl、pUC19去磷酸化質粒大片段2μl、T4DNA連接酶0.1μl和H₂O5.9μl組成。

2.根據權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌基因文庫的構建方法，其特征在于步驟六中待步驟五培養的菌落全部長出后用滅菌牙簽將每10個菌落接種于1mL含20mg/mL氨芐的LB液體中。