[發明專利]一種基于藻類葉綠素熒光的水體綜合毒性快速檢測方法

有效

• 申請號: 201310413222.1
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103728284A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 殷高方;肖雪;張玉鈞;趙南京;段靜波;胡麗;方麗;石朝毅;甘婷婷;余曉婭;董欣欣;劉建國;劉文清
• 申請（專利權）人: 中國科學院安徽光學精密機械研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

1.一種基于藻類葉綠素熒光的水體綜合毒性快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)受試藻類培養

以斜生柵藻作為受試生物，并配制SE培養基，高溫高壓滅菌，將藻種轉接到培養基中，放入光照培養箱中進行的擴大、馴化培養和藻種轉接，使藻種達到純化和同步生長，培養條件設置如下：光照2000-3000lux、光暗比14h∶10h、pH值8±1、溫度25±2℃，每日搖動1次，在藻類培養過程中，定期利用顯微細胞計數法測量藻類細胞生物量，繪制藻類生長曲線，最終得到處于對數生長期，細胞濃度在10⁴Cell/mL量級的受試藻液；

實驗在250mL的錐形瓶中進行，將受試藻液分成實驗組和對照組，每組100mL，在實驗組藻液中按體積比1∶1加入待測水樣，在對照組藻液中按體積比1∶1加入空白水樣，即蒸餾水)實驗組和對照組設定3個平行樣，培養過程中，每天搖動錐形瓶1次，通過改變培養瓶在光照培養箱中的位置，盡量保持實驗組與對照組的培養環境一致；

(2)多熒光參數的毒性測試反應終點建立

①快相葉綠素熒光測量

快相葉綠素熒光的測量采用英國Chelsea公司高速重復脈沖式熒光儀FASTflow，測量過程中，高速脈沖光激發光合系統II的反應中心產生大量電子，阻塞電子傳遞鏈，關閉光化學反應，產生快相葉綠素熒光；由于光合過程電子傳遞過程中電子受體Q_A和PQ的氧化還原周期不同，可以通過調節FASTflow激發光時序控制傳遞鏈電子阻塞位置，實現單周轉和多周轉兩種模式激發；

②快相葉綠素熒光分析

單周轉激發模式ST：使用高強度和高頻率激發脈沖光在Q_A單個光化學周轉120-160μs內將其全部還原，在Q_A處形成電子堆積，打斷光合作用的電子傳遞鏈，產生ST快相葉綠素熒光，利用(1-3)式可擬合和推算出PSII的有效吸收截面σ_PSII、電荷分離效率Φ_q和最大光量子效率Δφ_sat等熒光參數；

Fn=Fo+(Fm-Fo)·[1-exp(-En·σPSII)]·Σj=0n-1exp[-j(En·σPSII+Δτ/τdec)]---(1)]]>

Φ_q＝(F_m-F_a)/(F_m-F_o)??????????????????(2)

Δφ_sat＝(F_m-F_o)/F_m＝k·η_PSII??????????????????(3)

其中，F_n為第n個脈沖激發的熒光強度，E_n為第n個激發脈沖的強度，Δt為激發脈沖間隔；τ_dec為可變熒光衰減時間常數，F_o為本底熒光，F_a為環境光照下的熒光產率，F_m為反應中心完全關閉是的最大熒光，n_PSII為有效反應中心數量，k為常數；

多周轉激發模式MT：使用低頻脈沖光在60-500ms時間內提供激發能量，使Q_A發生更多氧化還原反應，將電子傳遞到PQ池，在PQ重新氧化前形成電子累積，阻塞光化學反應的能量傳遞，產生MT快相葉綠素熒光，利用(4)式可推算出PSII到PSI的電子轉移效率Φ_e；

Φe=FvST/FvMT=(FmST-FoST)/(FmMT-FoMT)---(4)]]>

式中和分別為單周轉和多周期模式下的本底熒光和最大熒光；

③毒性測試的反應終點建立

依據生物能流理論，捕光色素LHCII吸收光能后，通過色素間能量傳遞將能量轉移至有效光合反應中心RCII，激發反應中心葉綠素a分子，激發態葉綠素a分子共有三種去活化途徑，參與光化學反應P、熱能的形式散失H和向外輻射熒光F，光化學反應過程是利用激發能進行原初電荷分離，產生電子，電子經電子傳遞鏈Q_A、Q_B和PQ傳遞給光合系統I，最終轉化為固定二氧化碳的同化力，即ATP和NADPH，參與暗反應，從能流角度分析，參與光化學反應能量P與有效光合反應中心數量n_PSII，吸收截面σ_PSII、電荷分離效率為Φ_q、電子轉移效率為Φ_e線性相關，因此，在強度為I的光輻射下，P大小可按(5)式推算；

P＝I·η_PSII·σ_PSII·Φ_q·Φ_e＝I·k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat????????(5)

藻類光合作用速率Ψ是細胞吸收利用外界光能的效率，具體計算如(6)式所示；Ψ是光合系統對光能的吸收、傳遞和轉化效率的線性疊加，全面反映了光合作用的能量傳遞過程，能夠響應對光合系統作用位點和作用方式不同的物質毒性。因此，以Ψ作為毒性測試的反應終點，能夠有效測試重金屬、農藥和有機污染等物質毒性；

Ψ＝P/I＝k·σ_PSII·Φ_q·Φ_e·Δφ_sat??????????????????(6)

(3)毒性強度與藻類光合作用抑制率間的劑量-效應關系建立

①配制標準毒性參比物

采用國際經合組織和美國環保局制定的化學品毒性檢測標準方法藻類生長抑制試驗作為物質毒性評價的標準方法，以毒性穩定的HgCl₂溶液作為毒性參比物，進行藻類生長抑制實驗，按(7-8)式計算藻類的生長抑制率；以96小時50％的生長抑制率，即半數有效濃度EC_50-96作為1個綜合毒性當量，獲得HgCl₂溶液單位濃度的毒性強度；

μ_i-j＝(lnX_j-lnX_i)/(t_j-t_i)??????????????????(7)

式中μ_i-j為從i時間到j時間的比生長率；X_i和X_j分別為i和j時間的生物量；

I_r＝(μ_C-μ_T)/μ_C×100??????????????????(8)

式中I_r為以比生長率為基礎的抑制率，％；μ_C為對照組各平行樣藻類比生長率的平均值；μ_T為實驗組各平行樣藻類比生長率的平均值；

②建立藻類光合作用抑制率和綜合毒性強度間的劑量-效應關系

將HgCl₂毒性參比物分別配制成多個濃度梯度的被試物質溶液，并以相應溶劑做空白對照，等劑量加入到受試藻液，形成多個毒性強度梯度的實驗組和對照組，培養24小時后，測量快相葉綠素熒光曲線，計算出實驗組的Ψ和對照組的Ψ，利用(9)式計算出藻類光合作用抑制率I_g；

Ig:[%](1-Ψ(referenec)Ψ(sample))×100---(9)]]>

采用對數阻滯增長模型擬合毒性強度T與藻類光合作用抑制率I_g之間的劑量-效應關系如(10)式所示；

Ig=Igmin+Igmax-Igmin1+exp(m×(LogEC50-T))---(10)]]>

式中：I_g為光合性抑制率；

I_gmin為完全抑制毒性強度對應的光合性抑制率；

I_gmax為空白對照組對應的光合性抑制率；

T為綜合毒性強度；

EC₅₀為I_r對應的半數效應毒性強度，通過模型參數率定方式獲得；

m為T等于EC₅₀時擬合曲線斜率；

(4)水體綜合毒性強度定量檢測

按(11)式即可計算出樣品毒性強度T，待測水樣檢測結果取三個平行樣綜合毒性強的平均值。

T=LogEC50-Igmin+1m×ln(Igmax-IgIg-Igmin)---(11)]]>