[發明專利]一種疫苗組合物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201310412578.3
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN104415350A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;田克恭
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/40;C12N15/74;C12N1/21
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種疫苗組合物，以及制備方法和應用。

背景技術

兔瘟是對養兔業造成危害最大的一種病毒性傳染病，具有高度接觸致死性，其病原體是兔出血癥病毒（Rabbit?hemorrhagic?disease?virus，RHDV）。RHDV經呼吸道和消化道的黏膜進行感染，主要感染3月齡以上的家兔，發病率為90%-100%，致死率為95%-100%。

RHDV為杯狀病毒科（Caliciviridae）、兔病毒屬（Lagovirus），為單股正鏈RNA病毒，其基因組長7437nt，含有2個開放閱讀框（ORF），無囊膜，表面有殼粒。RHDV病毒粒子的衣殼由180個亞單位組成，這些亞單位在化學結構上完全相同，單體分子稱為VP60。VP60是RHDV的主要結構蛋白，分子量約為60kDa，可刺激機體產生中和抗體。

目前，疫苗免疫對RHDV的預防和/或治療起重要作用。然而市場上銷售的兔瘟疫苗大多為組織滅活苗，需通過注射免疫，且免疫后易出現結塊等副作用。另外，RHDV組織滅活疫苗在制備時，需將兔瘟病毒注射兔，取致死兔肝、脾組織進行滅活，從而導致出現病毒逃逸的生物安全問題。

陳寶林等公開了一種兔瘟疫苗（新劑型兔瘟疫苗的研究[J]中國畜禽傳染病19971：28-30），將攻毒后兔肝臟等器官經研磨后加入福爾馬林滅活加入油乳劑制成疫苗。然而該兔瘟油乳劑滅活苗吸收差，有大小不一顆粒及針頭狀出血點，免疫后25天尚未完全吸收。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物采用鼠傷寒沙門氏菌載體表達兔瘟病毒VP60蛋白，以制備RHDVVP60蛋白重組活載體疫苗，從而解決了現有的兔瘟組織滅活疫苗需通過注射免疫，及其免疫后所造成的易出現結塊等副作用的問題；還解決了現有的兔瘟組織滅活疫苗制備過程中，存在病毒逃逸的生物安全問題。

本發明的兔瘟疫苗組合物可通過口服途徑進行免疫，解決了現有兔瘟病毒疫苗需注射免疫，以及免疫后注射部位出現結塊等問題；制備過程也比較安全，同時避免了病毒逃逸的生物安全問題。

本發明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表達載體的沙門氏菌。

優選地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列為SEQ?ID?NO.2；更優選地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

優選地，所述表達載體為原核表達載體；更優選地，所述載體攜帶asd基因，可編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；進一步優選地，所述載體為pYA3341、pYA3342、pYA248、pYA262中的一種或幾種或其改進型。

優選地，所述沙門氏菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌；更優選地，所述沙門氏菌為asd基因缺陷型菌株；進一步優選，所述沙門氏菌為asd基因缺陷型減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550。

優選地，所述疫苗組合物進一步包括凍干保護劑，所述凍干保護劑為脫脂奶粉、蔗糖、明膠、海藻糖中的一種或幾種。

優選地，所述疫苗組合物中沙門氏菌含量為≥1×10⁹cfu/頭份；優選地，所述沙門氏菌含量為≥1×10¹⁰cfu/頭份。

本發明的另一目的在于提供一種疫苗組合物的制備方法，所述方法包括：（1）反轉錄兔瘟病毒VP60基因，將其連接到克隆載體擴增，然后連接到表達載體，獲得重組表達質粒；（2）將所述重組表達質粒轉入第一中間宿主菌擴增，然后轉入第二中間宿主菌進行甲基化修飾，獲得經甲基化修飾的重組質粒；（3）將所述重組質粒轉入終宿主菌，誘導表達，獲得兔瘟疫苗組合物。

優選地，所述步驟（1）中克隆載體為pGEM-T、pMD18-T、pMD19-T、PUC18的一種或幾種；所述的表達載體為攜帶asd基因、可編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的原核表達載體。

優選地，所述步驟（2）中所述的第一中間宿主菌為X6212，所述的第二中間宿主菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730；所述步驟（3）中所述的終宿主菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550，更優選為所述的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550為asd基因缺陷型菌株。

本發明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療兔瘟病毒性傳染病的藥物中的應用。

基于此，本發明具有以下突出的優點：