[發明專利]鑒別革蘭氏陰性和陽性菌的培養基及使用方法

在審

• 申請號: 201310412457.9
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103436589A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 趙貴明;陳穎;趙勇勝;楊海榮;劉洋;王娉;胡玥
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;王芝艷

技術領域

本發明涉及鑒別革蘭氏陰性和陽性菌的培養基及使用方法。具體而言，本發明涉及利用革蘭氏陰性菌特異性表達氨基肽酶在平板上鑒別革蘭氏陰性和陽性菌的培養基及使用方法。

背景技術

通過革蘭氏染色法，將細菌分為兩大類，即革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，是對細菌進行鑒別、分類和鑒定的基礎，因此，如何準確、便捷區分對于細菌鑒定與分類具有重要意義。

目前對于細菌的革蘭氏陰性和陽性區分以染色方法為主，先用龍膽紫（亦稱結晶紫）將細菌染成紫色，再涂以革蘭氏碘液加強染料與菌體的結合，然后用95％的酒精脫色20～30秒鐘，有些細菌不被脫色，仍保留紫色，有些細菌被脫色變成無色，最后再用復紅或沙黃復染1分鐘，結果已被脫色的細菌被染成紅色，未脫色的細菌仍然保持紫色，不再著色，結果凡被染成紫色的細菌稱為革蘭氏陽性菌(G^﹢菌)；染成紅色的稱為革蘭氏陰性菌（G^ˉ菌），其原理為：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色，為了保證實驗結果的準確性，還需要設置對照菌株，該方法自1884年由丹麥醫師Gram創立以來一直沿用至今，成為經典方法，但是這樣的常規方法使得操作過程繁瑣，雖然近年來已基于上述方法開發出細菌革蘭氏鑒定染色儀和基于流式細胞技術通過添加特制染料實現細菌革蘭氏鑒別，但這些方法需要專用設備的投入和特制試劑，不能滿足所有微生物實驗室的需求，而且鑒定前需要先分離出純菌落，并不能節省人力和時間。

1973年Teuber和Cerny(Arch.Mikrobiol.91,235-240,1973)首次描述了大腸埃希氏菌具有特異的氨基肽酶活性，認為可能所有革蘭氏陰性菌都具有該種特異性酶，C.Lazdunski（1975,Eur.J.Biochem.65,517-520）用L-丙氨酸-4-硝基苯胺（L-alanine-4-nitroanilide）作為酶底物，利用酶反應方法測試了從大腸埃希氏菌分離出的氨基肽酶活性，Murgier等人(1976,Eur.J.Biochem.65,517-520)用同樣方法測試了其他革蘭氏陰性菌并證實了上述觀點。1978年，G.Cerny用浸染了L-丙氨酸-4-硝基苯胺的濾紙鋪設在菌落上面進行孵育（5min），革蘭氏陰性菌具有的特異性氨基肽酶分解L-丙氨酸-4-硝基苯胺，釋放出對硝基苯胺使菌落產生黃色從而得到識別，從而建立了通過氨基肽酶測試來區分革蘭氏陰性、陽性細菌的方法(European?J.Appl.Microbiol.Biotechnol.5,113-122,1978)，但是，該方法所用酶底物由于分解后游離出的發色基團硝基苯胺具有極好的水溶性而迅速擴散，信號減弱，使得該方法不能將底物直接添加到培養基中應用，因此也就無法在菌落生長過程中直接用于革蘭氏陰性和陽性細菌的區分，隨后出現的同類酶底物L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸鹽（L-Alanine-AMC-TFA），由于釋放出的基團4-甲基香豆素為熒光基團，與4-硝基苯胺相比顯著提高了檢測靈敏度，替代L-丙氨酸-4-硝基苯胺用于人類醫學臨床樣本中L-丙氨酸氨基肽酶的測定，但由于仍未解決擴散問題，未見用于直接添加至平板中用于區分革蘭氏陰性和陽性菌。專利WO-A-98/04735和WO-A-99/38995描述了一種不會擴散的用于檢測氨基肽酶活性的顯色底物；中國專利200480003095.7描述了一種結構較為復雜的顯色酶底物；專利EP-B-0.270.946提出了基于吖啶酮的顯色底物，然而，這些底物一方面要么難于獲得（很難合成，純度和產量低，不能商品化），要么存在潛在的危害，另一方面，為了使菌落獲得明顯顏色變化需要精確調整培養基配方，使得目前市場上沒有商品化的產品出現。

綜上所述，傳統革蘭氏染色方法操作繁瑣，基于傳統方法原理的儀器測定需要設備投入，專用耗材成本較高；通過測定氨基肽酶區分細菌革蘭氏陰性/陽性菌的方法雖然特異性強，操作簡便，但沒有解決擴散問題，不能通過平板培養法進行區分革蘭氏陰性/陽性菌，成為該項技術不能在本領域進入實質性應用的技術瓶頸。