[發明專利]香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段、編碼蛋白及制備方法

有效

• 申請號: 201310411828.1
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103484483A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 黃敏;杜忠娟;鐘民濤;倫永志;劉奔;李星云;王曉麗;張偉;曹婧;寧安紅
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;A61P35/00;C12N15/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-2基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有Pkinase結構域，具有誘導腫瘤細胞凋亡和自噬、調節免疫及抗腫瘤、調節細胞周期等功能。?

背景技術

真菌富含多種生物活性分子，包括核糖體失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素樣蛋白、多糖和激酶。其中的抗腫瘤成分以不良反應少、療效顯著等優點在腫瘤治療方面具有獨到之處。香菇菌C91-3屬真菌為擔子菌亞門擔子菌綱側耳科，該菌種已于2013年保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益氣，扶正祛邪，增強機體免疫力，防治癌癥等功效。[Zhao?C，Sun?H，Tong?X，et?a1．An?Antitumor?lectin?from?edible?Mushroom?Agrocybe?aegerita[J]．Biochem?J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3發酵液中含有多種蛋白成分，通過動物體內實驗證實有些蛋白成分具有較好的抗腫瘤作用[黃敏，寧安紅，張卓然等．香菇C91-3菌絲發酵液小鼠體內抗腫瘤作用的研究[J]．中國微生態學雜志，1996，8(3)：38-40]。體外實驗也證實，其發酵液中的一些蛋白組分具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力[戴兵,黃敏,寧安紅.香菇C91-3菌絲發酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細胞株U14生長及誘導凋亡的實驗研究.浙江醫學，2004，26（9）；656?-658]。但是，迄今為止還沒有關于從香菇C91-3菌中提取可誘導腫瘤細胞凋亡和自噬的基因片段、編碼蛋白及制備方法等相關報道。?

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種從香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-2基因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有Pkinase結構域，具有誘導腫瘤細胞凋亡和自噬、調節免疫及抗腫瘤、調節細胞周期等功能。?

本發明的技術解決方案是一種香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段，其特征在于如SEQ?ID?NO：1?所示的核苷酸序列。?

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段編碼蛋白，其特征在于如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。?

一種上述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行：?

a.?提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

b.?將菌絲體總RNA反轉錄合成cDNA；

c.??PCR擴增目標基因：

以所得到的cDNA為模板、以具有BamHⅠ?和?XhoⅠ兩個酶切位點的PCR反應引物進行PCR反應；所述PCR反應引物序列如下：

上游引物BamHⅠ：

5'-GGCTGATATCGGATCCGAAAGCACTACAGCAGTTA-3'

下游引物XhoⅠ：

5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCAGAGACTGTAGTAAGCCC-3'

d.?回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化810bpMarker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。

所述a步驟是取培養18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉移至另一離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4?C，12000?r/min離心，15?min；吸取上層水相溶液并轉移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置15?min，再次4?C，12000?r/min離心，10?min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。?