[發(fā)明專利]香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段、編碼蛋白及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310411810.1
• 申請(qǐng)日: 2013-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN103484478A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃敏;張思若;劉奔;鐘民濤;倫永志;張偉;王曉麗;李星云;曹婧;寧安紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/10;C07K14/375
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段，其特征在于如SEQ?ID?NO：1?所示的核苷酸序列。

2.一種如權(quán)利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段編碼蛋白，其特征在于如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

3.一種如權(quán)利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a.?提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA；

b.?將菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

c.?PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因：

以所得到的cDNA為模板,?以具有EcoRⅤ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)引物序列如下：

上游引物EcoRⅤ：

5'-GATATCACTTATATGTTTCTGGGGAAGC?-3'?

下游引物XhoⅠ：

5'-CTCGAGTCTCCTCCCACTCAAC-3'

d.回收純化DNA片段：

將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化747bpMarker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制備方法，其特征在于所述a步驟是取培養(yǎng)18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續(xù)研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4?C,?12000r/min離心，15min；吸取上層水相溶液并轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置15min，再次4?C，12000r/min離心，10min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-18基因片段的制備方法，其特征在于所述c步驟的PCR反應(yīng)體系50μl：cDNA模板1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，dNTP?Mixture?4?μl、5×PrimeSTAR?Buffer?10?μl、PrimeSTAR?HS?DNA?Polymerase（2.5?U/μl）0.5?μl、滅菌蒸餾水33.5μl；反應(yīng)條件：98?C變性10s，55??C復(fù)性10s，72??C延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4?C冷卻10min。