[發(fā)明專利]富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310411299.5
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103480349A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉運(yùn)龍;謝軍;李煒;李川山;周曉;韋素梅;謝體三;蕭浩;潘艷坤;徐德林;林豐
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)糧油科學(xué)研究所
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01J20/30;G01N1/40
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素。醫(yī)學(xué)臨床和獸醫(yī)曾用來治療人及動物的多種感染性疾病。但氯霉素對造血系統(tǒng)有嚴(yán)重的毒副作用，已被臨床醫(yī)學(xué)和動物生產(chǎn)上禁止使用。我國規(guī)定在動物可食用組織不得檢出。但由于氯霉素價格低廉，效果明顯，仍存在違規(guī)使用，屢禁不止的情況，導(dǎo)致食品中氯霉素的殘留現(xiàn)象依然十分嚴(yán)重，對人體健康危害極大。免疫親和色譜柱是利用抗原抗體特異性識別的原理，定量檢測動物性食品、乳制品、水產(chǎn)品、蜂蜜及飼料中的氯霉素殘留，為食品中氯霉素殘留檢測，提供了一種高效，快速，特異的檢測方法。

氯霉素在食品中殘留的測定方法有多種，如:薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)、免疫學(xué)檢測等方法。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測物濃度低，大多數(shù)取樣量少。這就對分析方法的靈敏度、準(zhǔn)確度有更高的要求。免疫親和層析技術(shù)是一種集免疫反應(yīng)和層析技術(shù)相結(jié)合的分析方法，在提純物質(zhì)上是一項(xiàng)效率高、純度高、快速的技術(shù)，可以使免疫檢測技術(shù)(如ELISA等)和層析技術(shù)在特異性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，避免了免疫分析法直接測定樣品的不足。使用免疫親和色譜純化富集樣品中的氯霉素，可以很大程度的提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和分析的極限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高柱容量（高富集率）的氯霉素和/或氯霉素堿免疫親和吸附劑及其制備方法。

本發(fā)明所提供的富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑，是將氯霉素多克隆抗體和過碘酸氧化的固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物（吸附劑）；

所述氯霉素多克隆抗體可按照包括如下步驟的方法制備：以碘乙酰氯霉素堿與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原免疫非人哺乳動物得到抗血清，從所述抗血清中純化得到氯霉素多克隆抗體。

其中，所述非人哺乳動物可為兔、羊、鼠、豚鼠或馬等。

上述富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑中，所述碘乙酰氯霉素堿可按照包括如下步驟的方法制備；

1）將碘乙酸通過N,N-二環(huán)己基碳化二亞胺（N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）與N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）反應(yīng)生成活性酯，所述活性酯為NHS-碘乙?；钚怎?；

2）將所述NHS-碘乙?；钚怎ヅc氯霉素堿的一級氨基進(jìn)行?；磻?yīng)，得到碘乙酰氯霉素堿。

上述富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑中，所述1）可為將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N,N-二環(huán)己基碳化二亞胺在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到NHS-碘乙酰活性酯。進(jìn)一步，所述1）可為將碘乙酸、N-羥基琥珀酰亞胺和N,N-二環(huán)己基碳化二亞胺以269:695:582的摩爾比，在四氫呋喃中，20℃-25℃在黑暗中進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，以10000g離心，取上清液得到NHS-碘乙?；钚怎?；

所述2）可為a）和b）：

a）將氯霉素堿和三乙胺（催化劑）的四氫呋喃溶液和所述上清液（NHS-碘乙酰活性酯）在20℃-25℃進(jìn)行?；磻?yīng)，得到碘乙酰氯霉素堿混合物；所述氯霉素堿和三乙胺的四氫呋喃溶液的溶質(zhì)是氯霉素堿和三乙胺，溶劑是四氫呋喃；

b）將所述碘乙酰氯霉素堿混合物進(jìn)行HPLC純化收集保留時間為8.6分鐘的層析峰，得到碘乙酰氯霉素堿；所述HPLC純化中，檢測系統(tǒng)：SPD-M20A；色譜柱：UltimateXB-C18反相柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm；流動相：第0-5min（不包括第0分鐘）用乙腈和水按照11：9的體積比混合得到的混合液作為流動相，第5-10min（不包括第5分鐘）用乙腈和所述水按照13：7的體積比混合得到的混合液作為流動相，第10-12min（不包括第10分鐘）用乙腈和所述水按照11：9的體積比混合得到的混合液作為流動相，所述水用冰醋酸調(diào)至pH為3；檢測波長：254nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積，200μL；柱溫35℃。

上述富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑中，從所述抗血清中純化得到氯霉素多克隆抗體的方法包括：用所述碘乙酰氯霉素堿與巰基化固相載體偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為純化氯霉素多克隆抗體的親和層析介質(zhì)，從所述抗血清中通過親和層析純化得到氯霉素多克隆抗體。

上述富集氯霉素和/或氯霉素堿的免疫親和吸附劑中，所述親和層析中用體積百分濃度為3%的乙酸水溶液洗脫所述氯霉素多克隆抗體。