[發(fā)明專利]一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310410789.3
• 申請日: 2013-09-10
• 公開（公告）號: CN103451163A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;堵國成;康振;曹汶龍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/53;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125;C12R1/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

過氧化氫酶(catalase)簡稱CAT，其系統(tǒng)名稱是：H₂O₂氧化還原酶，以H₂O₂為專一底物，通過催化一對電子的轉(zhuǎn)移而最終將其降解為水和氧氣。過氧化氫酶在紡織、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)都有著廣泛的用途。過氧化氫酶在食品加工工業(yè)中可使食品保鮮，并作為消除啤酒、飲料中活性氧和自由基的抗氧化劑。與葡萄糖氧化酶并用作氧的去除劑，牛乳殺菌及干酪原料乳的殺菌；在醫(yī)藥行業(yè)常用于器械消毒；在臨床分析中，過氧化氫酶對研究自由基代謝失衡，抗衰老和腫瘤發(fā)病機理具有一定價值，對某些疾病的診斷，鑒別診斷亦具有重要意義上等行業(yè)有著廣泛的用途。迄今CAT已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)，以及與之相關(guān)的食品與乳制品業(yè)、紙漿和造紙業(yè)、以及農(nóng)業(yè)環(huán)保產(chǎn)業(yè)中有應(yīng)用價值的酶之一。近年來隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應(yīng)用，市場對過氧化氫酶的需求大幅增長。

近年來嗜熱子囊菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，蘋果炭疽菌、芽孢桿菌等微生物菌種均有用于過氧化氫酶的生產(chǎn)研究。但利用野生菌株生產(chǎn)過氧化氫酶，資源消耗大、原料利用率低、產(chǎn)量較低，難以滿足日益增長的市場需求；通過傳統(tǒng)方法育種，工作量大、盲目性大、回復(fù)突變率高，難以篩選得到理想的突變菌株。有通過重組大腸桿菌生產(chǎn)過氧化氫酶，但大腸桿菌本身產(chǎn)生的熱源、內(nèi)毒素不易除去，產(chǎn)品純化問題較多；蛋白的高水平表達常形成包涵體，提取和純化步驟繁瑣，而且蛋白復(fù)性困難，易出現(xiàn)肽鏈的不正確折疊等問題。生物安全性要求我們的宿主菌最好具有非致病性。而絕大多數(shù)芽孢桿菌恰恰能滿足這一要求，而且還具備了一些其他菌株所沒有的優(yōu)良特性。事實表明，芽孢桿菌可以作為一些原核生物、真核生物和哺乳動物等的外源蛋白的表達宿主。芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有的非致病性；細胞壁的組成簡單；能夠大量分泌某些胞外蛋白，蛋白跨越細胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單等優(yōu)點，使之成為CAT的良好表達宿主。

過氧化氫酶活性可被苯酚類、尿素、氰化合物、疊氮化物、堿等物質(zhì)所抑制，枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis?WSHDZ-01）具有耐熱耐堿的特性，且已用于工業(yè)化生產(chǎn)，利用該菌株作為宿主過量表達CAT，發(fā)酵條件易于控制，可大幅度提高CAT的產(chǎn)量。

江南大學(xué)的郭婭瓊從枯草芽孢桿菌（B.subtilis?WSHDZ-01）基因組中獲得編碼過氧化氫酶（CAT）的基因katA帶有自身信號肽和啟動子序列，與質(zhì)粒pSTOP1622上具有的木糖啟動子構(gòu)成了雙啟動子表達系統(tǒng)，在一定程度上增加了過氧化氫酶mRNA的轉(zhuǎn)錄量，促使CAT的表達，很大程度地提高了CAT的產(chǎn)量。但該過氧化氫酶也存在著一定的缺陷，尤其是其對溫度比較敏感，使得其在工業(yè)應(yīng)用中有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問題是提供一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體(CAT)。是對氨基酸序列如NCBI登錄號BAB21251.1所示的過氧化氫酶第114位的賴氨酸K進行定點突變，將含突變后基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）WSHDZ-01進行表達，得到酶活及熱穩(wěn)定性均增強的過氧化氫酶突變體。

編碼所述親本過氧化氫酶的核苷酸序列如NCBI登錄號為AB046412的序列所示。

所述突變是將第114位的賴氨酸K分別變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。

獲得所述突變體的方法，是以pSTOP1622-katA質(zhì)粒（一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，申請?zhí)枺?01110328753.1）為模版，設(shè)計引物，通過PCR進行定點突變得到含有突變后基因的重組質(zhì)粒pSTOP1622-katKX，將pSTOP1622-katKX轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌（B.subtilis?WSHDZ-01）發(fā)酵生產(chǎn)CAT。

所述枯草芽孢桿菌（B.subtilis?WSHDZ-01）購買于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CCTCC?NO：M206062。

獲得所述突變體的方法，具體地是：

（1）突變表達載體的構(gòu)建

通過分析過氧化氫酶的3D結(jié)構(gòu)，確定114位的賴氨酸K為目的突變?yōu)辄c，設(shè)計突變實驗，將該位點的賴氨酸分別突變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。