[發明專利]聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310410783.6
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103451300A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 步迅;夏子芳;劉艷艷;張全芳
• 申請（專利權）人: 步迅;夏子芳
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.聾病易感基因GJB2?235delC、299delAT突變檢測試劑盒，其特征在于包括擴增試劑和一系列標準品；所述擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl₂和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增GJB2：235delC、299delAT引物混合物，對上述位點進行特異性檢測的探針混合物，對人基因組DNA進行檢測的通用探針混合物，內對照及對內對照進行檢測的引物探針混合物；所述一系列標準品包括：235delC分型標準品、299delAT分型標準品。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：

用于GJB2：235delC、299delAT檢測的引物為：

SEQ?NO.1：5’-ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’；

SEQ?NO.2：5’-CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’；

用于GJB2：299delAT突變檢測的探針為：

SEQ?NO.5：5’-CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTCC-3’；

用于GJB2：235delC突變檢測的探針為：

SEQ?NO.6：5’-ACATCCGGCTATGGGCCTC-3’

用于對人基因組DNA進行檢測的通用探針為：

SEQ?NO.7：5’-ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3’；

其中LNA核苷以黑體字表示。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述的內對照為一段人工合成的序列裝載到pMD18-T的質粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ?NO.4)經過NCBI網站Blast沒有找到高相關的同源區。擴增序列及對內對照進行檢測的引物探針為：

SEQ?NO.8：CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC

SEQ?NO.9：5’-CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’

SEQ?NO.1O：5’-GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’

SEQ?NO.11：5’-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’

4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述的用于GJB2：235delC、299delAT突變檢測的探針，對人基因組DNA進行檢測的通用探針，內對照探針，每條探針的5’端和3’端均進行熒光染料標記，5’端為發光基團和3’端為淬滅基團。

5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述用于對GJB2：235delC、299delAT突變進行特異性檢測的探針，對人基因組DNA進行檢測的通用探針被分為四組，分別采用四種不同的發光基團對各組探針的5’端進行標記，3’端的淬滅基團可以為相同或不同的熒光染料。

6.根據權利4要求所述的試劑盒，其特征在于：探針所分為的四組為：用于對GJB2：299delAT突變進行特異性檢測的探針采用同一組發光-淬滅基團；用于對235delC突變進行特異性檢測的探針采用同一組發光-淬滅基團；對人基因組DNA進行檢測的通用探針采用同一組發光-淬滅基團；用于對內對照進行特異性檢測的探針采用同一組發光-淬滅基團。

7.根據權利4要求所述的試劑盒，其特征在于：5’端不同的發光基團所使用的熒光染料可以為：ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA、ROX、/Texas?Red、Cy5；3’端相同或不同的淬滅基團所使用的熒光染料可以為：BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。

8.根據權利1要求所述的試劑盒，其特征在于：包括一系列標準品：235delC分型標準品(10ng/uL的235delC雜合型突變DNA標本1管)、299delAT分型標準品(10ng/uL的299delAT雜合型突變DNA標本1管)。

9.權利要求1所述試劑盒應用于聾病易感基因的檢測，其特征在于通過熒光定量PCR特異性檢測聾病易感基因GJB2：235delC、299delAT；用于299delAT檢測的引物探針為：SEQ?NO.1、SEQ?NO.2、SEQ?NO.5；用于GJB2：235delC突變檢測的引物探針為：SEQ?NO.3、SEQ?NO.4、SEQ?NO.6；用于對人基因組DNA檢測的引物探針為：SEQ?NO.3、SEQ?NO.4、SEQ?NO.7；用于對內對照檢測的引物探針為：SEQ?NO.9、SEQ?NO.10、SEQ?NO.11。所述各位點的復合擴增采用聚合酶鏈式反應來實現，采用熒光定量PCR進行實時檢測，通過與標準品的同步擴增和分析，得出所測標本的分型信息或突變比例信息。