[發明專利]人工誘導石斑魚雌核發育魚苗的方法

在審

• 申請號: 201310409252.5
• 申請日: 2013-09-11
• 公開（公告）號: CN103493758A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 駱劍;陳國華;吳廷昌;黃飛;佘長寧;陳猛;樊佳偉;王珺
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于魚類遺傳育種領域，是一種海水魚類的培養方法及其應用，具體涉及使用異源精子誘導石斑魚產生雌核發育的培育和質量控制方法及應用。

背景技術

人工誘導魚類雌核發育技術是20世紀50年代在天然雌核發育魚類發現的基礎上發展起來的技術，該技術利用遺傳滅活的精子刺激卵子，并依賴雌配子發育成個體。由于雌核發育導致基因純合，在快速制備魚類純系等方面具有良好的應用價值。

淡水魚類的雌核發育開展的應用工作較多，而海水魚類國內外學者僅對大菱鲆、真鯛、大黃魚等十余種魚類開展了雌核發育的應用，熱帶海水魚類在這方面的研究與應用很少。石斑魚(Epinephalus)，屬于世界性名貴暖水性礁棲魚類，在我國南方形成了大規模的養殖產業。石斑魚養殖產業面臨著育苗成活率低、病害嚴重、個體大小參差不齊等亟待解決的問題，石斑魚優良品種的缺乏已經成為制約產業穩定持續發展的瓶頸因素。

選育出優良純系或品系是石斑魚良種培育的必由之路。作為一種先雌后雄的性反轉大型魚類，石斑魚性成熟時間長，個體發育為成熟雌性的時間長達3-5年，家系育種等手段耗時非常長，而1代雌核發育產生相當于7-8代自交選育的純合效果，能夠大大縮短品系選育的周期，因此采用雌核發育技術手段將顯著提高石斑魚良種培育效率。

發明內容

本發明要解決的問題是確定合適精子刺激源，并對人工誘導獲得的個體進行鑒定，實現批量高效制備雌核發育石斑魚純系群體。

為解決上述技術問題，本發明提出的方案為一種人工培育石斑魚雌核發育魚苗的方法，該方法包括如下步驟：

(1)雄魚的選擇和精子的采集：

選擇體格健壯體表無傷的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本(5-7齡)，體重60-80kg／尾，置于海上網箱或陸地池塘進行培育，投喂冰鮮雜魚和魷魚進行培育；待海水平均溫度穩定在28-32℃時，根據斜帶石斑魚排卵規律，提前1-2日給鞍帶石斑魚雄魚注射HCG(200U／kg)，20-28小時后將雄魚置于封閉網箱中，采用麻醉劑將其麻醉后撈出水面置于帆布擔架內擠精，采集的鞍帶石斑魚鮮精，使用精子稀釋液按照1：8-10比例稀釋，0-4℃冷藏保存；

(2)精子遺傳物質滅活

取稀釋過的鞍帶石斑魚精液平鋪在預冷的培養皿中，精子液面厚度控制在0.1-0.15mm，置于紫外燈箱中照射，照射過程中遮蔽自然光并置于搖床中進行，保持不停的搖動以確保精子照射均勻，紫外光照射劑量為40-60mJ／cm²

(3)人工授精的方法

鞍帶石斑魚紫外照射處理完成后，收集精子置于冰上避光保存；將待產斜帶石斑魚雌魚撈出，擦干體表水分，將成熟卵子擠入干燥刻度燒杯中；按照毫升處理精子授精40-60毫升卵子的比例進行精卵人工混合，混合45-90秒后加入潔凈自然海水完成人工授精；

(4)冷休克誘導石斑魚卵子

提前準備預冷的海水及冰箱，人工授精后4-8分鐘，用小手操網將卵子撈出，按照每50ml卵子使用2000-4000ml預冷的2-6℃海水的比例立即轉入預冷的海水中，低溫休克處理時間為15-25分鐘，經孵化桶孵化得人工培育石斑魚育苗。

在本發明的一個優選實施方式中，所述的精子稀釋液配方為TS-2：蔗糖110mM，KHCO₃?100mM，胎牛血清10％，Tris酸10mM。

在本發明的另一個優選實施方式中，所述的麻醉劑是丁香酚。

本發明以遺傳滅活的鞍帶石斑魚精子為刺激源，刺激斜帶石斑魚成熟卵子，激活后6min用4-6℃冷水休克處理20min，然后經孵化桶孵化，從而制備得到減數分裂抑制型的雌核發育石斑魚。

具體實施方式：

一、鞍帶石斑魚精子的遺傳失活及刺激斜帶石斑魚卵子雌核發育的方法

1.1雄魚的選擇和精子的采集：

選擇體格健壯體表無傷的鞍帶石斑魚雄性成魚為親本(5-7齡)，體重60-80kg／尾，置于海上網箱或陸地池塘進行培育，投喂冰鮮雜魚和魷魚進行培育。待海水溫度穩定在30℃時(海南省6-10月)，根據斜帶石斑魚排卵規律，提前1-2日給鞍帶石斑魚雄魚注射HCG(200U／kg)，24小時后將雄魚置于封閉網箱中，丁香酚麻醉劑將其麻醉后撈出水面置于帆布擔架內擠精。采集的鞍帶石斑魚鮮精，使用Ts-2精子稀釋液按照1：9比例稀釋，置于50mL管中4℃冷藏保存。

精子稀釋液Ts-2的配方為：蔗糖110mM，KHCO₃?100mM，胎牛血清10％，Tris酸10mM。

1.2精子遺傳物質滅活