[發(fā)明專利]用于無抗生素ColE1 質粒增殖的宿主-載體系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310409070.8
• 申請日: 2005-09-08
• 公開（公告）號: CN103555644B
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 萊因加德.格拉貝爾;艾琳.普法芬澤勒
• 申請（專利權）人: 勃林格殷格翰RCV兩合公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 張平元

本發(fā)明涉及用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主?載體系統(tǒng)。宿主?載體系統(tǒng)，利用ColE1?型質粒的基于RNA?拷貝數(shù)控制機制用于調節(jié)標志物基因的表達，容許進行質粒的無抗生素篩選并且可以用于產(chǎn)生質粒DNA和重組蛋白。

本申請是申請日為2005年09月08日、中國申請?zhí)枮?00580037778.9、發(fā)明名稱為“用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主-載體系統(tǒng)”的發(fā)明申請的分案申請。

本發(fā)明涉及質粒增殖領域，尤其是質粒DNA以及重組蛋白的產(chǎn)生。

利用質粒DNA作為基因轉移工具已經(jīng)廣泛用于基因治療領域。

在基因治療應用中，將攜帶治療性興趣基因的質粒導入到患者中，靶細胞中該基因的短暫表達導致期望的治療效果。

攜帶感興趣的治療基因的重組質粒可以通過培養(yǎng)細菌得到。為了篩選細菌轉化株并且為了保證質粒在細菌宿主細胞中的保持，通常地，將抗生素抗性基因包括在質粒骨架中。質粒的篩選通過將細胞在包含各自抗生素的培養(yǎng)基中生長而實現(xiàn)，其中只有攜帶質粒的細胞能夠生長。

利用抗生素抗性基因進行篩選質粒以用于基因治療具有以下缺點：

由于在基因治療中，完整的質粒被遞送，抗生素抗性基因導入到治療對象中。盡管這些基因被原核啟動子所啟動并且因此在哺乳動物細胞以及組織中沒有活性，存在將遞送的基因整合到細胞基因組中的可能性并且因此可能，如果在哺乳動物啟動子附近，可能被轉錄并且表達。

攜帶抗生素抗性基因的質粒第二個缺點是可能被帶有殘留的抗生素最終的產(chǎn)物污染。考慮到可能的免疫致敏性，這是一個問題，尤其是利用β-內酰胺抗生素的情形下。

為了避免這些風險，在禁止將抗生素抗性基因用于制備治療性質粒方面以及開發(fā)代替性的篩選方法方面已經(jīng)進行了不懈的努力。

在嘗試實現(xiàn)無抗生素篩選方面，已經(jīng)使用了能夠補償宿主營養(yǎng)缺陷型的質粒。但是，該方法以及所有相關方法的主要的缺點在于需要在質粒插入另外的基因(例如等，2004)。

另外一種方法是稱為“阻抑蛋白滴定”的思想(Wiliams等，1998)。根據(jù)該思想，包含kan基因(卡那霉素抗性基因)修飾的大腸桿菌宿主株在lac操縱子/啟動子控制下。在缺失誘導劑(IPTG或者異乳糖)的情形下，該株不能在包含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長。用包含lac操縱子的高拷貝數(shù)目的質粒轉化導致kan表達，通過從操縱子滴定lacI。在加入卡那霉素之后，只有包含高質?？截悢?shù)的細胞能夠生存。該思想的主要缺點再次地在于使用抗生素不可缺少。

本發(fā)明的目的在于提供一種不用抗生素的新穎的質粒篩選體系。

為了解決本發(fā)明的問題，已經(jīng)開發(fā)了通過使用帶有ColE1復制起點的質粒的復制機制(在下文中，帶有ColE1復制起點的質粒稱為“ColE1-型質粒”)。

大量天然存在的質粒以及許多最常用的克隆工具是ColE1-型質粒。這些質粒復制其DNA，利用涉及合成兩種RNA分子的常規(guī)的機制，這些分子一方面相互作用并且另一方面與模板質粒DNA相互作用(Helinski,1996；Kues和Stahl,1989)。

代表性的ColE1-型質粒是天然存在的ColE1質粒pMB1、p15A、pJHCMW1，以及常用的以及商業(yè)提供的克隆工具如pBR322以及相關的載體，pUC質粒、pET質粒以及pBluescript載體(例如Bhagwat和Person,1981；Balbas等，1988；Bolivar,1979；Vieira和Messing,1982)。