[發明專利]糖基化的麥芽糖結合蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201310409028.6
• 申請日: 2013-09-10
• 公開（公告）號: CN103509807A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 陳敏;楊公進;馬中瑞
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/245;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域：

本發明涉及一種糖基化的麥芽糖結合蛋白的制備方法及其制備方法與應用，屬于生物技術領域。

背景技術：

麥芽糖結合蛋白（Maltose?Binding?Protein，簡稱：MBP）是大腸桿菌麥芽糖轉運系統的成員之一，主要負責麥芽糖的捕獲和轉運。由于MBP融合表達重組蛋白具有表達水平高，易于純化等優點，MBP常作為融合標簽被廣泛應用。過去人們普遍認為MBP標簽沒有生物活性或生物活性較低，其融合表達的蛋白可直接進行生物活性研究。但最近有研究發現，MBP作為載體蛋白，能提高亞單位疫苗對抗病原菌的作用。MBP可通過作用于TLR4介導的信號通路，促進細胞因子的分泌和樹突狀細胞的成熟，增強細胞免疫應答作用。

將細菌多糖如O-PS、CPS連接到具有免疫原性的載體蛋白中形成糖-蛋白綴合物，此糖蛋白能引發依賴于T細胞的免疫應答，被認為是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有廣闊應用前景。合成糖蛋白疫苗的方法主要有化學法和酶法。目前被廣泛應用的是化學法，通過基因工程技術表達和純化載體蛋白，然后同提純的病原菌表面多糖進行化學耦聯。由于糖鏈化學激活的隨機性，交聯產生的糖蛋白具有高度不均一性；同時，此方法存在著步驟繁雜、操作困難等問題。近幾年興起的酶法利用空腸彎曲菌N-連接糖基化途徑同大腸桿菌脂多糖合成途徑相似性的特點，將空腸彎曲菌的一種寡糖基轉移酶PglB構建到大腸桿菌中，通過這種改造后的PglB介導的大腸桿菌糖蛋白合成系統，可以體內一步法合成糖蛋白。酶法克服了化學法的不足，具有很大潛力，近幾年其理論和方法也不斷改進和完善。

MBP表面某些特定的位置氨基酸序列的變化，如突變，缺失，插入等不會影響其本身轉運麥芽糖的活性。有研究證明，MBP蛋白第178位和341位氨基酸殘基插入7-13個氨基酸殘基，不會影響該蛋白的活性。天然的MBP沒有可被PglB識別的糖基化位點。因此建立一種方法使MBP可被PglB識別且有效糖基化成為合成糖蛋白的前提和關鍵。

發明內容：

本發明的目的在于建立一種有效的麥芽糖結合蛋白糖基化方法，同時將麥芽糖結合蛋白引入糖蛋白疫苗中，解決了現有技術中的空白和不足，也拓展了糖蛋白疫苗的范圍。

一種麥芽糖結合蛋白表達基因malE-Mut，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種麥芽糖結合蛋白，它是由SEQ?ID?NO.3所示氨基酸序列在178位和341位分別結合來自大腸桿菌O157:H7的脂多糖O-PS組成。

上述麥芽糖結合蛋白表達基因malE-Mut的制備方法，包括如下步驟：

（1）設計一對嵌合引物，其序列分別為：

malE-178-1：5’TGTTGCGTTCTGGTC，malE-178-2：5’GACCAGAACGCAACA；

設計一對模板基因的最遠端上下游引物，分別為：

k-waaL-F：CTCGAGAAAAAAAACTGGATAGCGTACTGGAACAGAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC和

k-waaL-R：TTACTTGTTTTTCATCGCTAATAATAAGCCGGCGTAAACATGGGAATTAGCCATGGTCC

然后以malE-178-1和k-waaL-F為引物，以malE基因為模板，合成PCR片段k-waaL-F-malE-178-1；然后以malE-178-2和k-waaL-R為模板，合成片段malE-178-2-k-waaL-R；

以PCR片段k-waaL-F-malE-178-1和malE-178-2-k-waaL-R混合物作共同模板，以malE基因為模板，合成PCR產物，制得在N178位插入五肽糖基化序列位點的malE突變基因；

（2）設計一對嵌合引物，其序列分別為：

malE-341-1：TGTTGCGTTCTGGTCACGCGGATCTTTCACCAACTC和

malE-341-2：GACCAGAACGCAACAATTGCCGCCACTATGGAAAAC

設計一對模板基因的最遠端上下游引物，分別為：

t-waaL-F：GTATGTCTCTTGCAGATTTG和

t-waaL-R：ATGGCGTAACTCAAAGATTC