[發明專利]一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201310407820.8
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103555742A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 江文正;胡雪菲
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N15/70;C12N9/64
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種人活性顆粒酶A重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)獲得人活性顆粒酶A的DNA片段

以含有人顆粒酶A全長基因的質粒pET24a-GzmA為模板，經PCR獲得所述人活性顆粒酶A的DNA片段；

b)構建重組表達質粒pET24a(+)-aGzmA

將所述人活性顆粒酶A基因的DNA片段和原核表達載體pET24a(+)分別用Nde?I和Xho?I雙酶切后回收酶切片段，利用T4DNA連接酶于16℃過夜連接，得到所述pET24a(+)-aGzmA重組質粒；

c)獲得人活性顆粒酶A表達菌pET24a(+)-aGzmA/BL21

將重組表達質粒pET24a(+)-aGzmA加入到冰預冷的大腸桿菌BL21感受態中，于冰上放置30min后于42℃水浴熱擊90s；加入無抗生素培養基培養1h后涂布于kan⁺LB平板，經37℃培養過夜，得到所述人活性顆粒酶A表達菌pET24a(+)-aGzmA/BL21；

d)人活性顆粒酶A重組蛋白的表達和鑒定

將所述人活性顆粒酶A表達菌pET24a(+)-aGzmA/BL21接種于LB培養基中，搖菌過夜后再轉接于新的LB培養基中，搖菌至OD600＝0.6～0.8之間；加入IPTG誘導表達6h后于12000rpm離心2min，得到含有所述人活性顆粒酶A重組蛋白的菌體；

e)人活性顆粒酶A重組蛋白的純化

將所述菌體用PBS重懸，置于超聲波破碎儀中進行超聲破碎；離心收集沉淀，經重懸、離心，過濾；將過濾后的溶液通過預處理好的鎳柱進行親和層析純化，得到純化的人活性顆粒酶A重組蛋白。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)的人活性顆粒酶A基因的PCR擴增中，上游引物序列(SEQ?ID?NO.1)：5’-GGAATTCCATATGATTATTGGAGGAAATGAAG-3′；下游引物序列(SEQ?ID?NO.2)：5’-CGCTCGAGAACTGCTCCCTTGATAGT-3’。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d)所述的誘導劑IPTG終濃度為1mM；2×SDS凝膠上樣緩沖液的成分包括100mM?pH6.8Tris-HCl、20％甘油、4％SDS、200mM2-巰基乙醇、0.2％溴酚蘭。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e)中所述鎳柱親和層析純化是：將NiSO₄通過親和層析凝膠柱以后，Ni²⁺與凝膠親和吸附；當帶His標記的人活性顆粒酶A重組蛋白濾液通過鎳柱時，人活性顆粒酶A重組蛋白與Ni²⁺親和吸附；用結合緩沖液和洗滌緩沖液洗去未結合的雜質，用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液使親和力減弱，將人活性顆粒酶A重組蛋白洗脫下來；將其加入到透析袋中，浸透在不含尿素和咪唑的緩沖液中，尿素和咪唑析出，得到高純度的人活性顆粒酶A重組蛋白。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述結合緩沖液的成分包括0.5M?NaCl、20mMTis-HCl、5mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗滌緩沖液的成分包括0.5M?NaCl、20mMTis-HCl、60mM咪唑、10％甘油、8M尿素；所述洗脫緩沖液的成分包括0.5M?NaCl、20mMTis-HCl、500mM咪唑、10％甘油、8M尿素。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述不含尿素和咪唑的緩沖液的成分為0.5MNaCl、20mM?Tis-HCl、10％甘油。