[發(fā)明專利]導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310407586.9
• 申請(qǐng)日: 2013-09-01
• 公開（公告）號(hào): CN104419678A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁炳煥;陳松長;李曉;舒靜;張琳;黃荷鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及導(dǎo)入hTERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)和SV40LT(猴腎病毒40大T抗原基因)重組子(SV40LT和hTERT介導(dǎo))構(gòu)建愛德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，主要用于生殖健康研究領(lǐng)域，為愛德華綜合癥的體外研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

背景技術(shù)

愛德華綜合癥，亦名18-三體癥，即患者多了一條18號(hào)染色體。該綜合征主要癥狀表現(xiàn)為患者頭有后凸的枕部、眼裂狹小、耳朵畸形、耳位低下、小頜、胸骨短小等。由于患兒存在嚴(yán)重的智力低下伴多發(fā)畸形，50％在出生后2個(gè)月內(nèi)死亡，可活至1年的不到10％，極個(gè)別可活到15歲。因缺乏有效的治療手段，一旦患兒出生將會(huì)給家庭和社會(huì)帶來極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已嚴(yán)重影響我國的人口質(zhì)量，已成為社會(huì)發(fā)展的沉重負(fù)擔(dān)和可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。

近年來，國內(nèi)外將愛德華綜合癥列為三大重大出生缺陷之一，作為重點(diǎn)干預(yù)對(duì)象，并建立了相應(yīng)的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法。在《國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的第十一個(gè)五年規(guī)劃綱要》中強(qiáng)調(diào)，要加大愛德華綜合癥等出生缺陷的干預(yù)力度，以改善出生人口素質(zhì)；在《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中將愛德華綜合癥等出生缺陷的研究列為優(yōu)先主題。

目前對(duì)愛德華綜合癥等出生缺陷的研究主要是針對(duì)遺傳、生物、物理、化學(xué)因素與發(fā)病(率)的關(guān)系以及其早期篩查和診斷方面，如國外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，18-三體等出生缺陷的發(fā)生與地區(qū)性、受孕時(shí)間、有害物接觸史等環(huán)境因素呈顯著相關(guān)；有國外文獻(xiàn)報(bào)道，近親婚配時(shí)所存在的兩個(gè)相同隱性基因與生育愛德華綜合癥等出生缺陷患兒有關(guān)；Graaf、Rudnicka等報(bào)道孕婦的體重、吸煙習(xí)慣、孕產(chǎn)次與愛德華綜合癥篩查指標(biāo)有關(guān)；另有國內(nèi)學(xué)者報(bào)道孕婦吸煙、微量元素、心理因素、飲食、TORCH感染等與愛德華綜合癥等出生缺陷相關(guān)。

但是，由于沒有理想的可在體外長期培養(yǎng)的、可用于發(fā)病機(jī)制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，就難以從細(xì)胞水平(以體外生長的活細(xì)胞替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)研究愛德華綜合癥受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制，從而嚴(yán)重限制了愛德華綜合癥的進(jìn)一步研究。

國外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin?DL、Kung?AL和Sulli?van?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。

但國外最近有研究發(fā)現(xiàn)，SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)某些研究也存在一定程度的限制性。

國外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對(duì)“正常”的生長特征。可以用于人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對(duì)借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。