[發明專利]hTERT基因重組構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310407553.4
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419676A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;李曉;舒靜;馬裕;鄭金川;黃荷鳳
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C40B50/06;C40B40/02
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技術領域

本發明涉及端粒酶逆轉錄酶催化亞基(hTERT)基因重組(介導)構建唐氏綜合征細胞模型及其細胞庫，主要用于醫學遺傳學研究領域，為唐氏綜合征的體外研究提供細胞模型并保存其科研資源。

背景技術

唐氏綜合征亦名21-三體綜合癥，即患者多了一條21號染色體，表現為先天愚型。我國每年新發唐氏綜合征(21三體綜合癥或先天愚型)1.6萬-2萬例，將造成經濟損失達73億-90億，給社會和家庭造成了嚴重的心理負擔和精神痛苦，已嚴重影響我國的人口質量，已成為社會發展的沉重負擔和可持續發展的嚴重障礙。

近年來，國內外將唐氏綜合征列為重大出生缺陷之一，作為重點干預對象，并建立了相應的產前篩查和產前診斷方法以預防唐氏綜合征的出生。在《國民經濟和社會發展的第十一個五年規劃綱要》中強調，要加大唐氏綜合征等出生缺陷的干預力度，以改善出生人口素質；在《國家中長期科學和技術發展規劃綱要(2006-2020年)》中將唐氏綜合征等出生缺陷的研究列為優先主題。

目前對唐氏綜合征等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學因素與發病(率)的關系以及其早期篩查和診斷方面，如國外有大量的文獻報道，21三體等出生缺陷的發生與地區性、受孕時間、有害物接觸史等環境因素呈顯著相關；Malini?SS等報道在18～29歲孕婦的21三體患兒中，91.3％具有外祖母高齡生育的特征；近親婚配時所存在的兩個相同隱性基因與生育唐氏綜合征等出生缺陷患兒的關系；Graaf、Rudnicka等報道孕婦的體重、吸煙習慣、孕產次與唐氏綜合征篩查指標有關；另有國內學者報道孕婦吸煙、微量元素、心理因素、飲食、TORCH感染等與唐氏綜合征等出生缺陷相關。

但是，由于沒有可在體外長期培養的、可用于發病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究唐氏綜合征細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了唐氏綜合征的進一步研究。

國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poulin?DL、Kung?AL和Sullivan?CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制。

但最近有研究發現，SV40Tag轉染的細胞伴隨著DNA損傷修復機制的丟失、核型的不穩定性以及少數細胞致瘤性轉化。此外，長期體外培養發現部分轉染SV40Tag的細胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數細胞會最終進入危機期(M2期)而死亡，說明細胞并未獲得永生化。同時SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發生、發展有關，因此SV40Tag轉染的細胞對某些研究也存在一定程度的限制性。

國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正常”的生長特征。可以用于人類和動物某些種類的細胞模型的建立，對借助于研究轉基因永生化細胞模型而研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制，具有重要的意義。

在口腔醫學領域，日本學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導培養后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。

但是，至今尚未見有關以hTERT構建可用于在體外從細胞水平研究唐氏綜合征發病機制的永生細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關項目的研究。為了解決上述問題，本發明人提出了本發明。

發明內容