[發明專利]重組淡紫擬青霉菌株PNVT8及其應用

有效

• 申請號: 201310406991.9
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103484386A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 何進;危雅樂;王階平;張艷;郝勃
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;A01N63/04;A01P5/00;C12R1/79
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

技術領域

本發明屬于農業微生物基因工程技術領域，涉及微生物農藥基因工程菌的選育和應用，具體涉及一株表達VHb蛋白的淡紫擬青霉菌株PNVT8及其應用。

技術背景

美國線蟲學家的研究表明，全世界每年因植物病原線蟲所導致的農作物損失率為12.3%，即植物病原線蟲每年可以造成1000億美元左右的直接經濟損失，而我國每年約損失133億美元，僅僅大豆因線蟲的危害就損失1億美元，對農作物的產量和農戶的收益造成了極大的沖擊。線蟲侵入植物后吸收植物體內的營養而影響其正常的生長發育，同時線蟲的分泌物還會刺激寄主植物的細胞和組織，導致植株畸形，使農產品減產和品質下降。此外，有些線蟲還能傳播真菌、細菌和病毒，導致植物快速死亡或減產。線蟲目前已經成為僅次于真菌的第二大植物病蟲害。我國較為嚴重的植物線蟲病有花生等多種作物的根結線蟲病、大豆胞囊線蟲病、小麥粒線蟲病、甘薯莖線蟲病、水稻干尖線蟲病、粟線蟲病、松材線蟲病、柑橘半穿刺線蟲病等。普通的物理方法，如輪番耕作、人工除蟲、翻耕曬堡等對線蟲的防治效果有限，且耗費大量的人力和物力，在現代農業中并不可取。目前主要是通過噴灑化學農藥來進行防治，但是已有研究表明化學農藥會殘留在作物表面，不僅對環境和土地形成了污染，而且也通過植物葉片、果實等被人體攝入進而直接影響人類的生存與健康。一些天然化合物如牛心樸子葉中的甲醇提取物、水楊酸和茉莉酸的甲醇混合物、苦豆子水提取混合物以及來源于微生物的阿維菌素等均能有效防止線蟲的危害，但這些天然化合物的成本也較高。進入二十一世紀后，發展新型、高效的微生物農藥制劑是國家的重要課題之一，是國家“世紀議程”的優先項目。為此，發展既環保又高效的殺線蟲制劑成為很多科研工作者的目標。淡紫擬青霉（Paecilomyces?lilacinus）已被證明是高效的植物病原線蟲的生防真菌，它是線蟲卵寄生真菌，也是植物根際土壤習居菌，在殺線蟲卵方面具有非常大的應用前景

淡紫擬青霉Paecilomyces?lilacinus?(Thom.)?Samson屬半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青霉屬，該屬主要特征是分生孢子梗呈瓶狀或近球形（瓶梗），在顯微鏡下觀察可看見其分生孢子梗和分支比其他的青霉菌要分散，在菌絲端或短枝上輪生，其分生孢子梗通過干燥的向基部鏈形成指頭狀分支，它的孢子形態從單孢卵圓形到紡錘形，無色。淡紫擬青霉在28℃固體PDA平板上培養時生長形成扁平、淡紫色的類似于紡錘形或橢圓形的特征菌落，在液體培養基上培養會形成乳白色菌球，同時使培養基更加透明澄清。

關于淡紫擬青霉寄生進而致死植物病原線蟲的機理目前還不是特別清楚，較為流行的說法是淡紫擬青霉直接侵入線蟲卵及其2齡以下的幼蟲。其大致過程為，當淡紫擬青霉與線蟲卵或幼蟲接觸后，其菌絲在粘性介質中快速生長，把線蟲卵的卵黃層撐大，出現3個厚度不均勻且不連續的薄膜，逐漸使卵細胞幾丁質層形成空泡，最終導致卵細胞脂質層的大量消失，后來通過電鏡觀察到，當淡紫擬青霉侵染線蟲時會分泌出幾丁質酶和絲氨酸酶，幾丁質酶可以水解線蟲卵細胞的卵黃層，使其失去完整性，進而使幾丁質層出現大空泡，使脂質層暴露、松散的散落在內層，同時絲氨酸酶發生作用，導致卵殼的結構發生較大的變化，使脂質層徹底消失，幾丁質層大量水解，最終使不完整的卵黃層和剩余的幾丁質層相連，最終導致卵細胞死亡。

具有高效、無毒并有利于在作物根尖定植等優點的淡紫擬青霉目前已經在全國范圍內有所推廣和應用，但是要淡紫擬青霉菌劑在防治柑橘、番茄、大豆等重要經濟作物的植物線蟲病中大規模的生產應用，就必須考慮成本問題。眾所周知，對于好養型菌株在大規模的發酵生產中，供養充足與否直接制約著其產量的高低及經濟效益，而目前的主要措施是通過改良發酵設備等手段來增加發酵過程中的溶解氧含量。然而，由于真菌生長代謝的特點，通過物理方法增加溶解氧依然不能滿足快速生長時期真菌對氧的需要。