[發明專利]基于組織因子的腫瘤核酸疫苗、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201310405991.7
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號: CN103566378A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 劉文濤;吳雪豐;徐禮友;楊政
• 申請（專利權）人: 南京海智生物工程有限公司
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/29;C12N15/70;A61P35/00
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 鮑夢熊

技術領域

本發明涉及一種核酸疫苗、制備方法及其應用，尤其是一種腫瘤核酸疫苗、制備方法及其應用。

背景技術

組織因子(tissue?factor,?TF)?的凝血功能眾所周知，它與活化凝血因子Ⅶ(activated?factor?Ⅶ,?F?Ⅶa)?結合后，形成TFPF?Ⅶa復合物，啟動外源性凝血途徑；亦可激活凝血因子Ⅺ，啟動內源性凝血系統。它是機體內活性最強的促凝物質之一，在生理性止、凝血過程及多種血栓栓塞性疾病中發揮重要作用。然而，TF作為凝血系統中惟一在細胞表面表達的跨膜糖蛋白，是否具有受體特性并具備非凝血功能，逐漸成為眾多學者關注的焦點。近期研究提示，TF具有信號傳導受體的功能，可通過介導多種信號傳導，影響腫瘤侵襲與轉移、胚胎發育、血管新生、炎癥、動脈粥樣斑塊形成等多種病理、生理過程。

以組織因子作為靶點來治療腫瘤是現在腫瘤研究中的一個熱點。最直接的優點就是靶向性好。正常的生理條件下，TF一般不外露，只有在腫瘤血管內皮和腫瘤細胞中才特異性表達升高。這就為腫瘤的靶向免疫治療提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能帶來全身性的凝血功能障礙。

國外學者以組織因子為靶點，進行免疫治療，最有成就的進展是HU和Garen將免疫球蛋白G1（IgG1）的Fab段換作凝血因子VII（FVII），即TF的天然配基，同時突變FVII的341密碼子：從賴氨酸AAG突變為丙氨酸GCC，使二者結合以后的促凝活性部分喪失。結果發現具有良好的抗腫瘤作用。但是，他們以TF全蛋白作為靶點，用抗體或FVII進行治療，存在著蛋白質結構復雜、工藝難度大、易引發機體過敏反應等缺點。

核酸疫苗是指將含有編碼抗原蛋白目的基因的質粒載體直接注入體內，通過宿主細胞的轉譯系統表達目的抗原，并誘導機體產生免疫應答的一類新型疫苗。由于其在體內選擇性表達目的產物，并將其以自然加工形式遞呈給免疫識別系統，故兼具重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導機體產生體液免疫和細胞免疫的雙重性，與傳統的疫苗相比具有免疫原性好、效果持久等特點。另外核酸疫苗可在工程菌中快速復制，制備提純方法簡便，大大降低了成本，已顯示出巨大開發潛力和應用前景。

核酸疫苗DNA骨架中除包含有編碼抗原基因的區域，在其質粒載體非編碼區中還含有由未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)基元組成的免疫刺激序列(immunostimulatory?sequences，ISS)。該ISS序列可作用于多種免疫活性細胞，增強非特異性免疫反應，激發淋巴細胞、單核細胞和樹突狀細胞擴增、成熟和分泌多種細胞因子、趨化因子以及免疫球蛋白。由于具有免疫刺激作用，ISS序列作為在位疫苗佐劑可極大增強核酸疫苗被細胞攝取后針對目的抗原產生的體液免疫和細胞免疫，在核酸疫苗的開發中具有極大的應用前景。總之，核酸疫苗除可用于預防和治療傳染性疾病以外，為治療自身免疫性疾病及腫瘤提供了新思路。

發明內容

本發明的目的是提供一種以組織因子為靶抗原表位的腫瘤核酸疫苗。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案為：一種基于組織因子的腫瘤核酸疫苗，以質粒為載體，質粒中插入編碼乙肝核心抗原（HBc）的DNA序列，并在該序列中插入編碼人源TF靶標表位多肽的DNA序列，人源TF靶標表位多肽序列見SEQ?ID?NO：1，該多肽為人源TF的74-94位氨基酸；所述質粒載體的非編碼區中含有ISS序列。

進一步的，所述編碼人源TF靶標表位多肽DNA序列插入HBc的第80-81位氨基酸所對應的核苷酸序列中。

本發明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤核酸疫苗的制備方法，其步驟包括：分別合成編碼人源TF靶標表位多肽序列、HBc序列和ISS序列的DNA，將這些DNA分步插入真核表達載體，構建重組質粒；轉化大腸桿菌工程菌；經堿裂解法對發酵后工程菌中的質粒DNA進行粗提；粗提液經純化，并用乙醇沉淀收集。

本發明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤核酸疫苗在制備預防和治療黑色素瘤藥物中的應用。

本發明還提供了上述的基于組織因子的腫瘤核酸疫苗在制備預防和治療乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌藥物中的應用。