[發(fā)明專(zhuān)利]利用湖羊生產(chǎn)抗ApoB多抗血清的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310405743.2
• 申請(qǐng)日: 2013-09-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103467601A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐志偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 鎮(zhèn)江萬(wàn)山紅遍農(nóng)業(yè)園
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/18
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗原生產(chǎn)方法，具體涉及一種利用湖羊生產(chǎn)抗ApoB多抗血清的方法及其使用方法。

背景技術(shù)

載脂蛋白B(ApoB)?在脂蛋白代謝中具有重要的生理功能,?是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CHOL）的主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是生物試劑的重要原料，現(xiàn)有的生產(chǎn)方法采用傳統(tǒng)的免疫方式，產(chǎn)量與效價(jià)較低，已無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的使用需求。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種可提高產(chǎn)量與效價(jià)的利用湖羊生產(chǎn)抗ApoB多抗血清的方法。

技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的利用湖羊生產(chǎn)抗ApoB多抗血清的方法包括以下步驟：

1）免疫原乳劑的制備，將含有ApoB抗原25mg的血清0.1ml，無(wú)菌PBS1.9ml，弗氏佐劑2ml混合并乳化，得到免疫原乳劑；

2）湖羊免疫第一針，在湖羊的前后腹股溝，每腹股溝分2個(gè)區(qū)域注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，皮下注射，足底部2個(gè)注射點(diǎn)平均注射；

3）與步驟2）間隔十天注射第二針，前后腹股溝分2個(gè)區(qū)域注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，后腹股溝淋巴結(jié)左右2個(gè)注射點(diǎn)；

4）與步驟3）間隔十天注射第三針，前后腹股溝分2個(gè)區(qū)域注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)；

5）與步驟4）間隔十天注射第四針，前后腹股溝分2個(gè)區(qū)域注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)；

6）與步驟5）間隔十天對(duì)免疫的湖羊動(dòng)脈采血，血液放入水箱中1小時(shí)溫度40oC，待血清充分析出，經(jīng)離心沉淀分離出抗血清，放進(jìn)冰箱保存溫度在4oC—8oC之間；

7）對(duì)步驟6）所得抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

作為優(yōu)選，所述步驟2）中注射的免疫原乳劑乳化時(shí)采用的弗氏佐劑是弗氏完全佐劑。

作為優(yōu)選，所述步驟3）、4）、5）中注射的免疫原乳劑乳化時(shí)采用的弗氏佐劑是弗氏不完全佐劑。

作為優(yōu)選，所述步驟7）的效價(jià)測(cè)定采用的方法為瓊擴(kuò)方法。

有益效果：本發(fā)明將ApoB抗原經(jīng)皮下注入湖羊腹股溝外并進(jìn)行多次加強(qiáng)免疫，使其產(chǎn)生高效羊抗ApoB抗體可達(dá)1:512以上。為生物試劑廠提供原料、為醫(yī)療診斷提供方便，使湖羊產(chǎn)生了高的效益。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用湖羊公羊25只，體重35公斤左右健康羊，免疫前全部打上耳標(biāo)，羊群采用圈養(yǎng)，結(jié)合放養(yǎng)，保持正常體況，避免羊只過(guò)肥，提高免疫力，自動(dòng)飲水器，每天牧草供給，適量添加精料、醋糟、麩皮和維生素等。

人的ApoB接種0.1ml（合抗原25mg）1.9ml無(wú)菌PBS完全弗氏（或不完全）佐劑2ml制成免疫原乳劑備用。

湖羊免疫第一針，前后腹股溝，每腹股溝分2個(gè)區(qū)域注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，皮下下注射，頸部?jī)蓚?cè)2個(gè)注射點(diǎn)平均注射。

第二針，間隔十天，前后腹股溝分2個(gè)點(diǎn)注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，后腹股溝淋巴結(jié)左右2個(gè)點(diǎn)。

第三針，間隔十天，前后腹股溝分2個(gè)點(diǎn)注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，后腹股溝淋巴結(jié)左右2個(gè)點(diǎn)。

第四針，間隔十天，前后腹股溝分2個(gè)點(diǎn)注射，總共12個(gè)注射點(diǎn)，后腹股溝淋巴結(jié)左右2個(gè)點(diǎn)。

其中第一針即第一次免疫注射的免疫原乳劑乳化時(shí)采用的弗氏佐劑是弗氏完全佐劑。

其余免疫中即第二、三、四針注射的免疫原乳劑乳化時(shí)采用的弗氏佐劑是弗氏不完全佐劑。

十天后對(duì)免疫的湖羊動(dòng)脈采血，血液放入水箱中1小時(shí)溫度40oC，待血清充分析出，經(jīng)離心沉淀分離出抗血清，放進(jìn)冰箱保存溫度在4o～C8oC之間；

采用瓊擴(kuò)方法對(duì)所得抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定

1.配制瓊脂：稱(chēng)取1.2g瓊脂粉，加入100ml生理鹽水中，水浴加熱溶解后，以115℃滅菌10分鐘；

滅菌結(jié)束后，取出瓊脂溶液，冷卻至70℃左右，用吸管吸取瓊脂液，加入干凈的平皿中，每塊平皿16ml，待冷卻后收起平皿，放于2～8℃冰箱中保存，可保存2周；

用前在平皿上用梅花打孔器打孔，中間孔加入抗原，外周孔加稀釋后的待檢血清。

2.樣品血清稀釋?zhuān)喝〕?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或血凝板，在每孔中加入25μl生理鹽水或PBS；

在每行的第1列孔中加入25μl樣品血清，從第1孔向后倍比稀釋至第10孔。

3.加樣檢測(cè)：取出打好梅花孔的瓊脂平皿，在外周孔中按順序加入倍比稀釋的樣品血清，每孔約加20μl，以孔加滿為宜；

在梅花孔的中央孔中加入上述分離出的抗血清；

將加好樣的瓊脂平皿放入濕盒中，置37℃過(guò)夜;

4.血清效價(jià)評(píng)定：

觀察外周孔與中央孔沉淀線出現(xiàn)位置，計(jì)算樣品血清的效價(jià)。測(cè)得第9孔有沉淀線（凝集反應(yīng)）說(shuō)明測(cè)定此批次抗血清的效價(jià)為1:512。