[發明專利]一種間接競爭酶連適配體檢測土霉素殘留的方法

有效

• 申請號: 201310404954.4
• 申請日: 2013-09-06
• 公開（公告）號: CN104374907A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 盧春霞;唐宗貴;羅小玲;劉長彬;康立超;李紅敏;陳霞;王靜;劉成江;李宇輝;侯小林
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種檢測食品中土霉素殘留的酶聯適配體分析方法(ELAA)，屬于食品安全分析技術領域。

背景技術

土霉素(Oxytetracycline，OTC)，別名5-羥基四環素，地霉素，地靈霉素，氧四環素等，是一種廣譜抗菌藥物，常作為牛、豬、家禽、魚等動物疾病的預防和感染的治療用藥，且由于其廣譜抗菌活性和低費用常被用作畜禽的抗菌促生長添加劑。但目前一些養殖者盲目追求利益，不遵守休藥期規定，造成畜禽和水產品中土霉素殘留嚴重，經過食物鏈被人體吸收后，可導致骨骼缺鈣和造成肝損害，最明顯的殘留毒性是誘導耐藥菌株。另外，土霉素在畜禽體內60%-90%以藥物原形或初級代謝產物的形式隨糞尿等排泄物進入環境，給對地表水、農田土壤甚至地下水造成污染，這將導致對人類公共健康產生嚴重威脅。許多國家對抗生素殘留實行監控，世界糧農組織、世界衛生組織、歐盟及我國政府規定土霉素的殘留限量不得高于100mg/kg。因此，加快對土霉素殘留的檢測的探究，建立高靈敏、準確、快速的檢測方法，對保障我國食品安全和消費者健康具有重要意義。

目前，檢測土霉素（Tetracyclines）的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳技術(CE)、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS)、薄層色譜法（TCL）流動注射電化學發光法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析分析法(GICA)等。儀器分析方法雖然靈敏度高、結果準確可靠等優點，但設備昂貴、操作復雜，檢測時間長，不能滿足大批量樣品篩選和現場快速檢測的需要。快速檢測方法通常采用抗原抗體特異相互作用識別模式，其中以ELISA和GICA方法應用最多。但由于受到抗體易失活、制備依賴免疫動物和細胞、且繁瑣費時、一些小分子物質難以產生特異性抗體等因素的影響，在一定程度上限制了抗體在快速檢測技術的應用。

核酸適配體（Aptamer）技術的出現彌補了抗體在相關檢測領域中應用的不足。Aptamer作為一種新型的識別分子，是采用指數富集配體系統進化技術(Systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX)從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選出的能與靶物質高特異性、高親和力結合的配體。其空間結構的多樣性幾乎可以與所有種類的靶分子（細胞因子、蛋白、生物毒素、金屬離子、小分子物質、細胞、微生物等）發生結合。與傳統的抗體相比，具有適應范圍廣；高親和力和特異性，不受免疫條件和免疫原性限制；制備簡單，可體外人工合成；變性與復性可逆，性質穩定；易于標記，可反復使用和長期保存等優點。顯然，適配體的這些特點對于發展高靈敏、高選擇性、快速高通量的靶標分子檢測十分重要，并日漸成為分析化學領域研究和應用的焦點。

目前已有關于酶聯適配體檢測土霉素相關文獻的報道，如劉賓（暨南大學碩士論文）建立了基于配適體的生物素-親和素酶聯檢測土霉素的分析方法，但檢測限低（1.5g/L），高于世界糧農組織、世界衛生組織、歐盟及我國政府對食品中土霉素殘留限量的規定（100?mg/L），不能滿足對土霉素檢測的需要。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種檢測食品中土霉素含量的酶聯適配體分析方法，其特點是以適配體代替傳統抗體，基于抗原和適配體特異性結合而建立的分析方法。該方法不需要制備抗體，操作簡便，靈敏度高，特異性強，能夠批量、快速檢測食品中土霉素的殘留。

本發明所提供的食品中土霉素殘留酶聯適配體（ELAA）檢測方法，通過以下步驟實現。

1．BSA-土霉素包被原的制備：采用文獻（Zhang?Y,?Lu?S,?Liu?W,?et?al.?J.?Agric.?Food?Chem.?2007,?55,?211-218）報道的鄰聯甲苯胺法將土霉素標準品通過同型雙功能團試劑（O-tolidine）與牛血清白蛋白（BSA）偶聯得到包被原。將BSA或OVA、OTC和偶聯產物，于波長190～600nm?下進行掃描鑒定。

2．間接競爭性ELAA方法。

（1）包被抗原：每孔加100μL?1600×?稀釋的包被抗原OTC-BSA，4℃孵育過夜，PBST緩沖液洗滌液3～5次，拍干。

（2）封?閉：每孔加入200μL?的封閉液，37℃孵育2h，PBST洗滌后烘干備用。

（3）加?樣：每孔依次加入50μL待測樣品或稀釋好的標品溶液，然后加入50μL?2nmol/L的適配體，37℃孵育1h，后洗滌液洗滌3～5次，拍干。