[發明專利]轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫

在審

• 申請號: 201310404008.X
• 申請日: 2013-09-01
• 公開（公告）號: CN104419725A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 翁炳煥;魯林榮;蔡志堅;毛愉嬋;潘玲;黃荷鳳
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C40B50/06;C40B40/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于醫學領域的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其主要特征是以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag?DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產物，構建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation?Mix連接經EcoR?I和Xho?I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化和鑒定后以脂質體轉染體外培養的巨核細胞，經G418篩選含陽性重組子的細胞并擴大培養，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞端粒酶活性、SV40LT和hTERT?mRNA表達、免疫組化、細胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導巨核細胞體外研究細胞模型凍存于液氮中，以建立在體外長期傳代培養巨核細胞的方法并用于體外研究巨核細胞發育、功能和病理機制。

2.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所指細胞模型為①巨核細胞同時轉染了SV40LT和hTERT基因而成為可長期傳代培養的永生化巨核細胞模型；②巨核細胞模型的染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”；③巨核細胞模型的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepato?ZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④巨核細胞模型不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；⑤為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；⑥巨核細胞模型的DNA同時整合了SV40LT和hTERT基因，同時表達SV40LT和hTERT基因的mRNA產物；⑦胞培養至第15-19周(約第130代)，仍處于對數生長期；⑧能反復凍存、傳代培養130代以上；⑨用于研究巨核細胞的功能；⑩可再生性地保存SV40LT和hTERT介導巨核細胞相關的遺傳資源。

3.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是原代巨核細胞取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后剩余、廢棄的含有巨核細胞的標本。

4.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是所用的培養液為含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol／L胰島素的低糖DMEM培養液。

5.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是用作脂質體轉染法導入重組子的巨核細胞，處于預培養后1-2天。

6.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是作染色體核型分析時，每5mL培養液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混勻后置37℃培養箱4小時。

7.根據權利要求1所述的轉染SV40LT和hTERT重組子構建巨核細胞模型及其細胞庫的方法，其特征是細胞庫的構建包括(1)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的SV40LT和hTERT介導的巨核細胞；(2)作傳代、擴大培養，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r／min，6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5×10⁵個／ml的細胞懸液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過夜；入-196℃液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT和hTERT重組子轉染法構建的巨核細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。