[發明專利]一種生物學評價受污染水體質量的方法

無效

• 申請號: 201310403058.6
• 申請日: 2013-09-06
• 公開（公告）號: CN103451295A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 杜志強;王建英;張雪峰
• 申請（專利權）人: 內蒙古科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 包頭市專利事務所 15101
• 代理人: 莊英菊

1.一種生物學評價受污染水體質量的方法，其特征在于，采用hsp70基因的表達模式進行水體質量評價。?

2.根據權利要求1所述的一種生物學評價受污染水體質量的方法，其特征在于，包含以下步驟：?

1）克氏原螯蝦的預養：取體重為20g-30g的活的克氏原螯蝦，在試驗室水族箱中用經過滅菌處理的自來水飼養1天-2天，獲得預養克氏原螯蝦；?

2）污水水樣的預處理：將采集來的污水水樣進行稀釋，并且平均分為3組，獲得稀釋后的3組水樣；?

3）克氏原螯蝦的脅迫刺激試驗：將步驟（1）中的預養克氏原螯蝦放入步驟（2）稀釋后的3組水樣之中，進行脅迫刺激，取樣時間點分別為脅迫刺激開始之后的6h、12h、24h、48h、72h、96h，獲得各個取樣時間點對應的脅迫刺激的克氏原螯蝦；?

4）克氏原螯蝦總RNA的提?。簩τ诓襟E（3）中的各個取樣時間點對應的脅迫刺激的克氏原螯蝦進行肝臟取樣，要求每只克氏原螯蝦肝臟的取樣量為20mg-30mg，而且要求一個取樣時間點上取3-5只克氏原螯蝦的肝臟組織混合在一起之后，進行總RNA的提取，獲得各個取樣時間點對應的脅迫刺激的克氏原螯蝦肝臟總RNA樣品；?

5）克氏原螯蝦cDNA的反轉錄合成：將步驟（4）中的各個取樣時間點對應的脅迫刺激的克氏原螯蝦肝臟總RNA樣品進行反轉錄合成cDNA，獲得各個取樣時間點對應的克氏原螯蝦肝臟組織cDNA樣品；?

6）實時熒光定量PCR技術確定克氏原螯蝦hsp70基因的表達模式：以步驟（5）中的各個取樣時間點對應的克氏原螯蝦肝臟組織cDNA樣品作為模板，進行實時熒光定量PCR反應，使用的引物分別為hsp70基因的一對引物hsp70-qRT-F：5`-caccagatgaaggagttg-3`和hsp70-qRT-R：5`-aatgaaacactttcaggt-3`和作為內參的18S?rRNA基因的一對引物18S-qRT-F：5`-tcttcttagagggattagcgg-3`和18S-qRT-R：5`-aaggggattgaacgggtta-3，實時熒光定量PCR反應結束之后，獲得反應過程對應的溶解曲線，并且進行Ct值讀數，獲得各個取樣時間點對應的Ct值；?

7）數據分析：對步驟（6）中獲得的各個取樣時間點對應的Ct值數據進行分析，以正常的沒有經過污水脅迫刺激的克氏原螯蝦作為0h對照組，具體分析方法為：數據的計算形式為2^-ΔCt，其中每一個取樣時間點的ΔCt=（MT基因平均Ct值-18S?rRNA基因平均Ct值），之后以0h對照組的2^-ΔCt值作為對照，取樣時間點6h、12h、24h、48h、72h、96h對應的的2^-ΔCt值與其比較，分析hsp70基因相對表達量的上調情況，當hsp70基因的最高上調表達量與0h對照組相比存在顯著差異時，即差異分析中的P值<0.05記為*，那么定義污水水樣存在較為嚴重的生?態毒理危害，即水體污染較為嚴重，當hsp70基因的最高上調表達量與0h對照組相比存在極顯著差異時，即差異分析中的P值<0.01，記為**，那么定義污水水樣存在極為嚴重的生態毒理危害，即污染非常嚴重。?

3.根據權利要求1所述的一種生物學評價受污染水體質量的方法，其特征在于，實時熒光定量PCR采用具體擴增程序的反應條件為：95℃預變性3min，之后為反復進行的循環階段，每個循環設置為：95℃變性30s，60℃退火35s，并且從55℃-95℃按照每秒升高0.5℃的進度進行熒光數值讀取，獲得反應過程對應的溶解曲線。?

4.根據權利要求1所述的一種生物學評價受污染水體質量的方法，其特征在于，利用T檢驗的數據分析方法分析取樣時間點6h、12h、24h、48h、72h、96h對應的2^-ΔCt值與0h對照組對應的2^-ΔCt值之間顯著性差異的p值，來定性評價克氏原螯蝦hsp70基因的表達模式與水樣污染程度之間的關系。?