[發(fā)明專(zhuān)利]火木層孔菌中甲基苯二酚在抗禽流感H5N1病毒上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310401654.0
• 申請(qǐng)日: 2013-09-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103816137A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙晨;宋愛(ài)榮;孔超;黃芳;梁大勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61K31/05
• 分類(lèi)號(hào): A61K31/05;A61P31/16;C07C39/08;C07C37/70;A01G1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗禽流感H5N1病毒的火木層孔菌中活性物質(zhì)的提取制備方法，尤其涉及的火木層孔菌菌種，已于2013?年8月26日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，?保藏編號(hào)為CGMCC?No.8108，分類(lèi)名稱(chēng)為火木層孔菌?Phellinus?igniarius，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。?

背景技術(shù)

????苯二酚能與蒸汽一起揮發(fā)，是強(qiáng)還原劑，遇明火能燃燒，受高熱散發(fā)出有毒、有腐蝕性氣味，能經(jīng)皮膚引起中毒，能升華，對(duì)中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)有刺激作用，大鼠經(jīng)口LD50為3890mg/kg，與間苯二酚及對(duì)苯二酚不同。?

目前，抗禽流感病毒的藥物種類(lèi)主要集中于單克隆抗體，種類(lèi)單一，有一定的局限性。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開(kāi)了一種從藥用菌中分離的具有抗禽流感活性的甲基苯二酚。本方法較一般化合物應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)在于：發(fā)現(xiàn)了該種甲基苯二酚的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。為抗球流感病毒提供了新的思路與方向。?

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：?

首先制備火木層孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計(jì)是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將火木層孔菌菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，以20～35℃溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動(dòng)培養(yǎng)7～15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5～4時(shí)，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20～35℃，發(fā)酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7～15天，即可利用火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液制備火木層孔菌粗提物；

(3)取步驟(2)中所得火木層孔菌菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對(duì)上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～8倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60～90%，乙醇優(yōu)選為濃度65-95%的食用乙醇，所用體積優(yōu)選為濃縮液體積的3-6倍；

(5)對(duì)步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時(shí)；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過(guò)二級(jí)過(guò)濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得火木層孔菌粗提物。

然后從火木層孔菌粗提物中甲基苯二酚，步驟如下：火木層孔菌粗提物→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→TLC檢測(cè)→正相硅膠層析→甲醇凝膠層析→TLC檢測(cè)→正相硅膠層析→TLC檢測(cè)→減壓蒸干→為3-甲基-1,2-苯二酚。?

具體方法為：?

(1)?制備火木層孔菌粗提物；

(2)將步驟（1）所得的乙醇沉淀物與正相硅膠混勻攪拌，干燥后進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫2-5次，得到洗脫液；

(3)將步驟（2）中最后一次洗脫液減壓蒸干，等體積硅膠拌樣，進(jìn)行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；

(4)收集步驟（3）得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，使用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測(cè)收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；

(5)用步驟4得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行正相硅膠層析，洗脫劑為氯仿與甲醇；

(6)TLC檢測(cè)，適度合并洗脫液，加壓干燥，即為甲基苯二酚。

優(yōu)選的，提取步驟(2)中所述的拌樣硅膠為100-200目正相硅膠，層析硅膠為正相200-300目，洗脫劑為氯仿和/或甲醇；?

????提取步驟(3)中所述的硅膠用量為等體積，洗脫劑為石油醚：丙酮=20:1-40:1；

提取步驟(4)中所述的凝膠為Sephadex?LH-20，洗脫劑為甲醇；

提取步驟(5)所述的洗脫劑為氯仿：甲醇=100:1-150:1；

提取步驟(6)所述的TLC檢測(cè)，展開(kāi)劑為氯仿：甲醇=25:1-40:1。