[發明專利]一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201310401419.3
• 申請日: 2013-09-06
• 公開（公告）號: CN103520716A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 侯文禮;馮曉
• 申請（專利權）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）禽流感工作種子批毒種的建立：將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種；

（2）病毒接種與培養：于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔接種稀釋為10^-5稀釋度的H7N9禽流感工作種子批毒種，每胚0.1ml；將雞胚置?33~35℃培養40~60小時；挑選活胚置4℃冷胚15~20小時，收獲病毒尿囊液；

（3）病毒滅活：將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在40℃下滅活24~36小時；

（4）病毒收獲液澄清與濃縮：將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10?um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/l的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；

（5）病毒純化：蔗糖速率區帶離心：分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度離心3小時；

（6）病毒裂解：純化后的病毒液加入等量的終濃度為0.3~1.0%的Triton?X-100，混勻后置20~25℃下作用2小時；

（7）再滅活：將步驟（6）制得的裂解液加入甲醛在2~8℃下滅活24~36小時；

（8）除糖除裂解劑：將步驟（6）制得的裂解物用相對分子質量為100K的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/l的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000rpm/min的條件下離心1~3小時；

（9）除菌過濾：將步驟（8）制得的病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液；

（10）半成品配制：根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4?mg/ml的氫氧化鋁佐劑，混勻后于20~25℃攪拌吸附4小時，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。

2.根據權利要求1所述的禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于：步驟（5）中，病毒純化的具體過程為：當區帶離心轉速達到3000rpm/min時，泵入病毒液、33%蔗糖及56%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進樣完畢，再調節機器轉速至25000rpm/min，離心3小時。