[發明專利]大豆根瘤菌玻璃化凍存液及玻璃化凍存大豆根瘤菌的方法

有效

• 申請號: 201310400318.4
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103421693B
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 于德水;沙長青;趙曉宇;奚新偉;戴肖東;張先成;王天亮;姜宏宇
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/41
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

大豆根瘤菌玻璃化凍存液及玻璃化凍存大豆根瘤菌的方法。它涉及一種微生物玻璃化凍存液及玻璃化凍存微生物的方法。它提供了一種含有乙二醇且化合物組成簡單的大豆根瘤菌玻璃化凍存液及玻璃化凍存大豆根瘤菌的方法。大豆根瘤菌玻璃化凍存液由甘油、乙二醇、DMSO和蒸餾水組成。玻璃化凍存方法：將大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化凍存液中；然后將大豆根瘤菌玻璃化凍存液投入液氮中快速玻璃化凍存。本發明用于微生物保存領域。

技術領域

本發明涉及一種微生物玻璃化凍存液及玻璃化凍存微生物的方法。

背景技術

根瘤菌是一類生活在土壤中的革蘭氏陰性桿狀細菌，在合適的條件下根瘤菌能侵染豆科植物并與之進行共生結瘤固氮。據估計，根瘤菌所固定的氮約占生物固氮總量的65%,在農業生產中起著極其重要的作用。菌種資源是我國豐富的自然資源寶庫的重要組成部分，隨著生物學技術的不斷發展，種質資源的利用對生命科學的研究起著越來越重要的作用，對菌種保藏技術也提出了越來越高的要求。為了使自然界分離得到的野生型菌種和人工選育得到的用于科學研究和工業生產等方面的優良菌種盡可能長時間地發揮作用，需采用各種適宜的方法妥善保存以保證菌種成活和遺傳性狀的穩定，使之不發生或盡可能少發生變異。因此，菌種保藏是一項重要的基礎工作。

低溫冷凍保存作為嶄新的保存方法，日益受到人類的重視，其中玻璃化冷凍保存技術是一條簡捷而很有潛力的方法。玻璃化凍存技術是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法，以該種方法凍結的細胞懸液沒有冰晶的形成，直接液體轉變為非晶態的固化過程。利用玻璃化方法在動、植物細胞保存中普遍獲得成功，但在微生物保存領域極為少見；而且，現有玻璃化凍存液中所含成分繁多，除了水之外多數由5～6種化合物組成。由于乙二醇對動物有毒性，所以基本上都以聚乙二醇等作為玻璃化凍存液組成成分。

發明內容

本發明提供了一種含有乙二醇且化合物組成簡單的大豆根瘤菌玻璃化凍存液及玻璃化凍存大豆根瘤菌的方法。

大豆根瘤菌玻璃化凍存液按質量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸餾水組成。

利用上述大豆根瘤菌玻璃化凍存液玻璃化凍存大豆根瘤菌的方法按以下步驟進行：

將大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化凍存液中，大豆根瘤菌菌液與大豆根瘤菌玻璃化凍存液的體積比為2:3；然后將大豆根瘤菌玻璃化凍存液投入液氮中快速玻璃化凍存；

大豆根瘤菌玻璃化凍存液按質量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸餾水組成；

玻璃化凍存降溫速度大于2000℃/min。

大豆根瘤菌還不同于其他微生物，其可產生相當量的胞外粘液，因此阻礙了目前已有玻璃化凍存液的凍存效果，導致大豆根瘤菌大量失活，存活率低；目前已有玻璃化凍存液凍存大豆根瘤菌，其保存1年后的存活率不足70%。本發明采用甘油、乙二醇和DMSO（二甲基亞砜）作為玻璃化凍存液，可以有效地穿透大豆根瘤菌的胞外粘液，從而對大豆根瘤菌進行玻璃化凍存。

經本發明玻璃化凍存的大豆快生根瘤菌及慢生根瘤菌菌株，保藏12個月后其菌株存活率均可達到85%以上，且固氮酶活性沒有明顯下降。本發明玻璃化凍存液及玻璃化凍存方法對大豆根瘤菌具有優異的保藏作用。

實驗未發現經本發明玻璃化凍存的大豆根瘤菌有任何異常現象發生，說明玻璃化凍存液中的乙二醇對大豆根瘤菌無不良影響。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。